【一柱分乾坤】全面解读柱层析技术

王中泰

【一柱分乾坤】全面解读柱层析技术

柱层析技术(chromatography) 又称柱色谱技术，主要原理是根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，经多次反复分配将组分分离开来。

适用范围

1. 样品量要适中（适用于g-公斤级），如果样品量只有几百克至一克，可以考虑使用制备TLC纯化（俗称爬大板），既可以得到良好的分离效果，又可以节省大量的纯化时间。

2. 样品要有良好的溶解性，否则会导致化合物在硅胶上极难解析下来，从而导致硅胶柱堵塞。

3. 样品在TLC板上产物与杂质点要有一定的分离度，而不是在一个点上，硅胶板的分离效果要高于柱层析，如果硅胶板都显示无法分开的话，尽量不要选择柱层析纯化，而可以考虑使用制备HPLC，SFC或其他分离方法。

操作过程

干法上样为例

1.装硅胶：在减压抽滤的状态下，将硅胶加入玻璃柱中

2.抽结实：减压抽气至10min，将硅胶抽实

3.上样：将拌好硅胶的样品，加入硅胶上层

4.加石英砂：加入缓冲层

5.石油醚淋洗：加入低极性溶剂淋洗，开始润柱时，一定要选取低极性的溶剂淋洗，可以充分稀释残留的大极性溶剂，以免色谱带在柱子上出现抢跑现象

6.加缓冲球开始过柱

装 柱

1. 选择什么类型的柱子
加压柱：速度比较易于控制，但是由于需要在柱子上方加装一个磨口，限制柱子直径至多在10cm左右，约束它的的最大上样量。适合小于100-200 g产品的纯化。大尺寸的加压柱难以制作，用起来危险性大。在公司过柱时，请使用双链球加压。减压柱：适用比较广，但是如果控制不好真空度的话，流速会非常快，同时溶剂很大一部分被抽走，适合任何量的过柱, 比加压柱快，需要减小流动相极性过柱(比加压柱小一倍), 不然会导致分离效果差。常压柱：适用于量大的物料，但流速较慢。适合大于50-100g的产品，常压柱是分离效果最好的，但是时间也最长。

2. 选择多大柱子
过柱前知道样品的量，伴样硅胶是样品量的1-2倍，柱子中的硅胶是10-30倍这些硅胶在加入柱子后的径高比在1:5-1:10为比较合适的比例。如果比例太小1:1,1:3，硅胶高度不够，分离度比较差；如果比例太大，1:10,1:20，这样流速会非常慢。

3. 注意事项及技巧
过柱前爬板拿标样，并且NMR确认：过柱前，先拿到标样后，再开始过柱，因为在过柱过程中，你得到点往往比爬小板得到点的要多，如果每个点进行确认的话，时间损耗非常大。

取硅胶时必须带口罩：硅胶吸入肺中，是无法代谢出身体的，会得矽肺病。

必须时需要碱化硅胶：硅羟基为弱酸性，所以它可以和胺类物质发生反应，从而使化合物难以洗脱下来，需要在过柱前，使用三乙胺或氨甲醇碱化后再开始上样。
硅胶可以用量筒量取，雷竞技百科 ：体积=1:2，节省时间

上 样

1. 上样方式有几种，各有什么特点
干法上样：将化合物用低极性溶剂溶解后，加入1-2倍重量的硅胶拌样，而后璇干成砂状，具良好流动性，这种上样的优点是易于操作，谱带比较整齐，但一定注意的是化合物是否有热固稳定性。
湿法上样：上样需小心谨慎，操作要求较高，适合易溶化合物，该法优点是非常高效。用少量小极性溶剂溶解样品，缓慢加入柱上层

2.注意事项：

a.干法上样时，拌样前样品和溶剂要求干燥（硅羟基与水分的结合是非常紧密的，一旦带有过多的水分进入柱子后，硅胶就会失活，分离效率就会降低）；

b.使用干法上样时，大极性的溶解溶剂一定要完全旋掉后才上样（大极性溶剂易导致洗脱剂极性加大，从而产物直接被洗脱下来

过柱接收

1. 流动相极性怎样选择：用TLC板上Rf=0.2-0.3的极性过柱，上下有杂质点时，适当减小极性

       一般选取产物Rf值在0.2-0.3之间的流动相体系比较适合，如果有靠得比较近的杂质，就要酌情减少流动相的极性。

2. 怎样接收使产品更纯选择合适极性的流动相：选取流动相的时候，可以多使用几个不同的展开体系，来爬板尝试。

接收瓶和接收时机的选择：

a.产品没有出来的时候，可以用稍大接收瓶接收；

b.产品快出来的时候，用稍小接收瓶接收；

c. 产品快要出完的时候，用稍小接收瓶接收。简称“掐头去尾”

3. 怎样使过柱接收时间更短

在保证产品足够纯度的情况，如何更快速的完成柱层析，下面两点可以帮助提高速度：

a.使用梯度淋洗（梯度淋洗具有收尾作用，可以减小谱带的宽度，从而降低收集产品所需的洗脱剂体积，减少了配洗脱剂接收洗脱液以及浓缩所耗费的时间。

b. 流动相在旋蒸完后，可以套用，减少配溶剂的时间：使用回收套用的溶剂，这一点，尤其适用比较大量的产品，可减少溶剂获取时间，同时降低分离成本。

4. 注意事项及技巧

a.  使用干燥的流动相，特别是在潮湿的天气，可以用干燥剂干燥流动相后过柱

b.  用完溶剂桶及时放回安全的地方

c.  尤其是化合物第一次过柱时，产品没有彻底确认之前，不要扔掉其他化合物也不要处理硅胶柱。

另外总结一下湿法过柱的技巧

TLC是有机化学家们的眼睛，要想过要柱子，前面一定要点好板子。柱层析里面的门道还是很多的，多少克的硅胶过多少克的产品；

根据TLC点板情况，是很复杂，还是很简洁，该选择多少目的硅胶；产物的酸碱性决定我们是用普通硅胶，还是氧化铝进行柱层析；有时候EA/PE体系过不开的体系，尝试用DCM/PE说不定就可以过开等等。
湿法上样的技巧

点好TLC以后，让目标点的Rf值在0.2～0.3,浓缩好粗品后，用少量二氯甲烷溶解，用吸管延着硅胶顶部的柱壁均匀滴下粗样，然后再垫上一层硫酸钠或者石英砂，再加压冲一下，使其充分吸附在顶部硅胶上，再用小极性溶剂，如石油醚先冲一下，稀释一下顶部DCM的浓度，其他过柱技巧参考干法上样。湿法过柱适合一些极性比较大的产品的纯化，另外对一些热敏感的化合物也实用。

yujiansp

谢谢楼主分享