标准曲线拟合小贴士

王中泰

标准曲线拟合小贴士

我们在分析化学的学习过程及实际实验中，总是会遇见 “ 标准曲线 ” 的概念。在物质定量、测定浓度等实验中有举足轻重的地位，对当今生活中的农业生产、食品健康、医药卫生等事业也有重要的帮助。那么标准曲线究竟是什么？它能告诉我们什么？什么标准曲线才是合格的？我们又该如何通过标准曲线获得可信的结果呢？本文将围绕这些问题展开讨论。

图 1 常见标准曲线

标准曲线是什么？

标准曲线是指在分析化学实验中，通过测定一系列已知组分的标准物质的物理或化学属性，得到该属性的数值所组成的曲线。即是用来描述被测物质浓度与响应值之间关系的曲线。

图 2 标准曲线中的普通变量与随机变量

在分析化学实验中，标准曲线法是一种常用的定量分析方法，通常情况下的标准工作曲线是一条直线。标准曲线的横坐标表示可以精确测量的变量，称为普通变量，纵坐标表示仪器的响应值，称为随机变量。当横坐标取值为 X1 ， X2 ， …… Xn 时，仪器测得的纵坐标值分别为 Y1 ， Y2 ， …… Yn 。将这些测量点 Xi ， Yi 描绘在坐标系中，用直尺绘出一条表示 X 与 Y 之间的直线线性关系，这就是常用的标准曲线法。用作绘制标准曲线的标准物质，它的含量范围应包括试样中被测物质的含量，标准曲线不能任意延长。用作绘制标准曲线的绘图纸的横坐标和纵坐标的标度以及实验点的大小均不能太大或太小，应能近似地反映测量的精度。

标准曲线能告诉我们什么信息？

由上文的介绍可知，标准曲线反映了我们已知的普通变量与仪器响应值之间的关系。具体来说，标准曲线可以帮助我们确定未知物质的浓度，通过比较未知物质与标准曲线上已知浓度的标准物质的响应值，可以推算出未知物质的浓度。比如用紫外测定未知浓度溶液时，即可应用标准曲线法得出结论。

可通过以下操作实现：

1 、通常需要配置已知浓度的标准溶液。

2 、并用紫外分光光度计测出每个梯度浓度所对应的紫外值。将未知浓度的溶液也测量其紫外值。

3 、将已知浓度的紫外值与浓度值对应，作出如图 1 所示的曲线。并进行拟合。

4 、将未知浓度带入拟合公式中，求出浓度。

此外，标准曲线还可以用来验证分析方法的准确性和灵敏度，评估方法的线性范围和检测限等性能参数。标准曲线所描述的关系应该是线性的，如果曲线呈现非线性关系，那么就需要对实验条件进行调整，以获得更准确的结果。在实际应用中，标准曲线是建立分析方法的重要步骤之一，能够帮助我们更好地理解和掌握被测物质与分析方法之间的关系。

什么样的标准曲线才是合格的？

在明确了标准曲线的原理后，我们可知，一条合格的标准曲线应该具备以下特征：

1. 线性关系：标准曲线的横坐标与纵坐标之间应该存在线性关系，即可以通过一条直线来拟合数据点。标准曲线的相关系数（也即 R 值）应该接近于 1 ，这表明实验数据与拟合直线之间的相关性较好，我们通常会以 “ 几个 9” 来表示标准曲线的好坏，也即 R 值如果接近于 1 ，则通常是大于 0.9 的数值，但如果小数点后出现多个 9 ，也即 0.999 或 0.9999 等 “ 三个 9” 、 “ 四个 9” 等情况，可知该曲线线性非常好，可信度很高。如果数据点呈现非线性关系，则需要对实验条件进行调整来使其线性化。

2. 精度和准确度：

标准曲线所得到的结果应该具备较高的精度和准确度，即实验数据应该紧密地聚集在拟合直线周围，且拟合直线的斜率和截距应该与理论值相近。

例如紫外分光光度法测定浓度实验中，扣除空白对照的紫外光吸收强度后，所做出的标准曲线截距理论上应该为 0 ，若依然有截距，则代表曲线可能不准，需要优化。

3. 线性范围：

标准曲线的线性范围应该覆盖实验中所涉及的被测物质浓度范围。如果线性范围过窄，则需要重新测定。例如在 Bradford 测定蛋白浓度中，其说明书会讲述两种标准曲线的配置方案（如图 3 ，图 4 所示）。分为较浓标准曲线和较稀标准曲线，较浓曲线量级在 50~300 ug/mL ，而相比之下，较稀标准曲线则比前者稀了 10 倍。所以在使用前，用户需要提前预估待测蛋白的浓度，尽大可能确保待测液的紫外吸收值落在标准曲线范围内。如果没有，禁止将超出标准曲线的紫外吸收值直接带入标准曲线计算。

图 3 Bradford 法测定蛋白浓度标准曲线配置说明书，正面

图 4 Bradford 法测定蛋白浓度标准曲线配置说明书，背面

如何通过标准曲线获得可信结果？

在标准曲线的配置及测量中，提高操作的精准度对 R 值非常有影响。在这里提出以下意见：

1 、在溶液配置时，取溶剂使用移液枪可能会造成一定误差，体积也会受温度和溶剂表面张力影响。为了提高精度，在取溶剂时可以使用雷竞技百科 法，用溶质雷竞技百科 分数代替溶液浓度，能够得到更精确的测量数据。

2 、提前确定合适的标准曲线范围，并根据范围合理配置标准母液浓度，母液浓度不易过浓液不宜过稀。在配置时，可以将母液取出目标梯度溶液的稀释前相应体积，然后统一加溶剂稀释到同一体积，最终获得标准曲线；也可以先配置出梯度中最浓的标准溶液，然后从中取出一部分进行稀释。

然后下一梯度同样可以取上一梯度的一部分溶液进行稀释获得。两种方法各有优劣，前者可以配置任意设计的浓度梯度诸如等差数列梯度，且如果结果中有某个点偏离影响过大，可以删去；后者则只能配置倍数梯度的标准溶液，而且因为每一点的浓度都取自前一梯度，若某一个点出现问题，则只能将该浓度后的点全部删去。

3 、在拟合时，只可使用一次函数拟合，此时的 R 值可信。因为标准曲线是依据朗伯比尔定律得出的一次函数关系。若所测得的标准曲线呈现一条 “ 标准的抛物线 ” ，此时只能重新配置，不可使用多项式拟合等其他拟合，即便 R 值拟合后再高，也不可信。

4 、若未知样品浓度过高，超过标准曲线范围，不可直接带入计算！标准曲线不可延长。标准曲线只在较稀的一定范围内呈现线性关系，如果超出了这个范围，即便只是超出一点，也很可能出现浓度稀释两倍但吸收值却没有下降两倍，结果仍然没有下降入范围内的情况。所以要保证稀释到标准曲线范围内，才可以代入计算。

yujiansp

谢谢楼主分享

美图图

谢谢楼主分享

余苏木

谢谢楼主，受教了