驼乳及其制品中的动物源性成分的鉴定

王中泰

超高效液相色谱-串联质谱法鉴定驼乳及其制品中的动物源性成分

前言

目前 , 动物乳市场朝着多元化方向快速发展 , 除普通牛乳外 , 骆驼乳、山羊乳、水牛乳、马乳、驴乳、牦牛乳等特种乳受到人们的广泛关注。联合国粮农组织 (FAO) 的数据显示 , 截止到 2020 年 , 牛乳仍占全球生鲜乳生产量排名的榜首 , 水牛奶、山羊奶、绵羊奶和骆驼奶等特种乳产量相对较低 , 其中骆驼乳产量远低于其他动物乳。

驼乳营养丰富 , 被誉为 “ 沙漠白金 ”, 不含有过敏原 β- 乳球蛋白 , 适合过敏症患者 , 且成分与人乳相似 , 可以作为人乳替代品。由于骆驼乳产量低 , 乳供应量明显受季节性波动的影响 , 且奶源雷竞技百科 难以控制 , 骆驼乳及其制品成为蓄意掺假的目标。向高价值的骆驼乳及其制品中掺入低价值的牛、羊等动物乳是最常见的掺假行为 , 这不仅会造成消费者的经济损失 , 还可能危害消费者的身体健康。

因此 , 亟需建立一种准确、高效的驼乳及其制品中的动物源性成分测定方法。

常用的骆驼奶和其他物种奶的鉴别主要采用基于 DNA 的聚合酶链式反应 (PCR) 、基于蛋白质组学的质谱 (MS) 、二维凝胶电泳 (2-DE) 与核磁共振 (NMR) 等方法。然而 , 由于多重引物设计要求高 ,PCR 方法无法实现 8 个物种同时检测 ;2-DE 方法分辨率较低 , 需要结合 MS 方法进行验证 , 这两种方法均增加了实验的复杂性 ; 而 NMR 方法无法靶向识别目标物 , 需要额外的数据解析。

基于蛋白质组学的质谱多反应监测 (MRM) 技术克服了以上问题 , 具有通量高、特异性强且操作简便的优势 , 可根据不同物种本身蛋白质氨基酸序列的细微差异识别动物乳来源 , 同时可以高效、准确地靶向定量多个物种的特征肽段。

本文将超高效液相色谱 - 四极杆 / 静电场轨道阱高分辨质谱 (UHPLC-Q/Exactive-HRMS) 和超高效液相色谱 - 三重四极杆质谱 (UHPLC-QqQ-MS) 相结合 , 筛选出骆驼、家牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、驴和马共 8 个物种的 22 个特征肽段 , 并建立了以特征肽段为分析对象的骆驼奶 / 奶粉掺假鉴别和定量方法。

1 样品前处理
吸取 10 mL 液态乳 ( 或称取 1 g 奶粉用超纯水定容至 10 mL), 于 -20 ℃ 冷冻 10 min, 10000 r/min 下离心 5 min, 然后用玻璃棒挑去液态乳上层的脂肪层。取 200 μL 脱脂乳 , 加入 800 μL 乙腈 ( 含 1% 甲酸 ), 振荡混匀 ,-20 ℃ 放置 30 min 。 10000 r/min 下离心 5 min, 弃去上清液。加入 1 mL 超纯水悬浮沉淀并振荡混匀 ,10000 r/min 下离心 3 min, 弃去上清液。向沉淀中加入 800 μL 50 mmol/L NH4HCO3 溶液 ( 含 6 mol/L 尿素 ), 涡旋振荡 5 min 。观察无明显颗粒 , 用 50 mmol/L NH4HCO3 溶液 ( 含 6 mol/L 尿素 ) 定容至 1 mL 。用超纯水稀释 5 倍后待酶解。

2 、 酶解
吸取 200 μL 试样于 1.5 mL 低蛋白吸附离心管中 , 加入 200 μL 500 mmol/L NH4HCO3 溶液 ,10 μL 500 mmol/L DTT, 涡旋混匀 , 于 75 ℃ 恒温水浴中振荡 30 min 。静置至室温 , 加入 20 μL 500 mmol/L IAA, 混匀 , 置于暗处避光反应 30 min 。加入 10 μL 100 mmol/L CaCl2 溶液 , 向离心管中加入 20 μL 100 μg/mL 的胰蛋白酶溶液 ,37 ℃ 酶解过夜。放至室温 , 加入 10 μL 甲酸终止反应 , 涡旋后静置 15 min 。加水补至 1 mL, 用 0.22 μm 低蛋白吸附滤膜过滤 , 滤液待上机检测。

3 、 UHPLC-Q/Exactive-HRMS 条件
采用 UHPLC-Q/Exactive-HRMS 进行多肽生物标志物的鉴定。

色谱条件 色谱柱为 Aeris peptide XB-C18 柱 (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Phenomenex, USA), 流动相 A 为 0.1%(v/v) 甲酸水溶液 ,B 为 0.1%(v/v) 甲酸乙腈溶液。液相色谱梯度洗脱程序 :0~4 min, 97%A; 4~19 min, 97%A~30%A; 19~20 min,30%A~10%A; 20~24 min, 10%A; 24~25 min, 10%A~97%A; 25~30 min, 97%A 。流速 :0.2 mL/min; 进样体积 :10 μL; 柱温 :40 ℃ 。

质谱条件 电喷雾电离 (ESI) 源 , 正离子模式 ; 喷雾电压 3.5 kV, 毛细管温度 320 ℃ , 辅助气体温度 250 ℃ , 鞘气压力 206.85 kPa, 辅助气压力 68.95 kPa; 采用全扫描数据依赖的二级离子扫描模式 , 扫描范围为 m/z 300~1500 ; 全扫描一级质谱和二级质谱的分辨率分别为 70000 和 17500 。

4 、 UHPLC-QqQ-MS 条件
采用 UHPLC-QqQ-MS 定量检测特征肽段。
色谱条件 XBridge BEH Amide XP 色谱柱 (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm), 流动相 A 为 0.1%(v/v) 甲酸乙腈溶液 , 流动相 B 为 0.1%(v/v) 甲酸水溶液。梯度洗脱程序 :0~2 min, 5%A; 2~11 min, 5%A~55%A; 11~13 min, 55%A;13~13.1 min, 55%A~5%A; 13.1~15 min, 5%A 。流速 :0.3 mL/min, 进样体积 :5 μL; 柱温 :40 ℃ 。

质谱条件 ESI 源 , 正离子模式 ; 雾化气 : 氮气 ,2 L/min; 加热气 : 空气 ,12 L/min; 干燥气 : 氮气 ,6 L/min; 碰撞气 : 氩气 ; 离子源接口温度 :350 ℃ ; 脱溶剂管 (DL) 温度 :300 ℃ ; 加热模块温度 :400 ℃ 。

结论
本研究基于蛋白质组学技术 , 将 UHPLC-Q/Exactive-HRMS 和 UHPLC-QqQ-MS/MS 相结合 , 共筛选出 8 个物种的 22 条特征肽段。基于此 , 建立了以特征肽为分析对象的骆驼奶 / 奶粉的掺假鉴别和定量测定方法 , 并对 11 个实际样品进行检测 , 以确保标签的真实性。所开发的方法 , 具有高灵敏、高通量和可重复性等优点 , 有望为骆驼乳及其制品掺假检测提供一种有力的技术平台。

文章信息

色谱 , 2024, 42(1): 13-23

DOI:10.3724/SP.J.1123.2023.07027