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发酵过程中尾气(CO2、O2)对发酵的影响及控制
在发酵过程中,尾气组分浓度的变化反映了整个发酵过程物质的变化情况,尤其是尾气中的CO2、O2的变化,可以反应出发酵状态及菌体微观生长情况。CO2是细胞分析和分解代谢的终产物,还是某些合成代谢的基质。几乎所有发酵均产生大量CO2。CO2的产生是一种非常重要的生长指标,特别是适用于早期生长阶段。在对数生长期CO2的释放在一定条件下与细胞量成正比。监测CO2的生成是跟踪生长活动的有效方法。O2是构成细胞本身及代谢产物的组分之一。对于好氧发酵,无论是基质的氧化、菌体的生长或是产物的代谢均需要大量的氧。
近年来,尾气分析在发酵中的应用研究越来越广泛深入。这些对于深入研究发酵过程机理,摸索、优化发酵工艺,全面控制发酵过程具有重大意义;尤其在基因工程、生物制药领域,能够大大加快新品研发及产业化,稳定生产,提高产率。
1、何谓CER、OUR、RQ? CO2释放率(Carbon-dioxide Escape Rate,CER)是指单位时间、单位体积发酵液细胞释放的CO2量。 摄氧率(Oxygen Uptake Rate,OUR)是指单位时间,单位体积发酵液细胞消耗的氧。OUR取决于菌体浓度,也与发酵液的营养成分、溶解氧水平、菌体的生长速率以及碳源的种类和浓度等因素有关。
CER除以OUR所得的商称为呼吸商(Respiratory Quotient,RQ)呼吸商是各种碳源在发酵过程中代谢状况的指示值。在碳源限制且供氧充分的情况下,各种碳源都趋向于完全氧化,呼吸商应接近于其理论值。而供氧不足时,碳源不完全氧化,可使呼吸商偏离理论值。 通过尾气在线检测分析可获取发酵过程中重要的呼吸代谢参数CO2释放率(CER)、摄氧率(OUR)和呼吸商(RQ)等。这些参数反应了微生物的代谢情况,尤其能提供从生长向生产过渡或主要基质间的代谢过渡指标。无论对动力学研究还是优化工艺、全面控制发酵过程、提高产量产率都具有重大的意义。
2、尾气(CO2、O2)对2.1. CO2对发酵的影响 CO2是微生物的代谢产物,同时也是某些合成代谢的一种基质,是细胞代谢的重要指标。高浓度的CO2会影响产黄青霉的菌丝形态,而大多数微生物适应低CO2浓度(0.02%~0.04%体积分数)。当尾气中CO2浓度高于4%时,微生物的糖代谢与呼吸速率可能会下降。同时,CO2的主要作用是在细胞膜的脂肪酸核心部位,当细胞膜的脂质相中CO2浓度达到一临界值时,膜的流动性及表面电荷密度发生变化,这将导致膜对许多基质的运输受阻,影响了细胞膜的运输效率,使细胞处于“麻醉”状态,生长受抑制,形态发生变化。
2.2. O2对发酵的影响 O2在好氧深层培养中是重要的,因为它是需氧发酵控制最重要的参数之一。由于氧在水中的溶解度很小,在发酵液中的溶解度亦如此,因此需要不断通风和搅拌,以满足不同发酵过程对氧的需求。
3、发酵过程状态识别 微生物发酵是个复杂的生化过程。在宏观上表现为整个发酵过程的有规律性,即一般都经过迟滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期。然而由于诸多因素的影响,又使各个发酵阶段与具体的时间关系表现为无规律性。这给发酵过程的准确控制带来困难。因此正确辨识发酵各个阶段对于过程优化控制具有重要意义。
研究表明,无论对于霉菌、酵母菌、细菌,单液相体系、双液相体系,纯种发酵、混菌发酵,CER的变化与体系状态的变化有着密切联系,根据CER 的变化规律可以有效、准确地把握发酵过程。研究发现对青霉素、古龙酸、二元酸和葡萄糖酸发酵四个体系 CER的变化规律进行研究分析了CO2释放与发酵各个阶段的关系,证明CER用于过程判断及控制是可行的。有学者发现在十三碳烷烃生产十三碳二元酸发酵中发现随着菌体生长,CER 不断增大,当菌体生长基本停止时,CER达到最大值,然后便开始下降。据此可以通过CER 来及时确定进入产酸期的最佳时间, CER达到最大值时。
有学者利用在线检测OUR对特定发酵阶段的比生长率进行预估,再利用预估值进行发酵阶段的在线辨识,并应用于100L诺西肽发酵。依据辨识得到的发酵阶段为0~13h 为延迟期,13~38h 为指数生长期,38h 以后为稳定期。该结果与实际过程相一致。这种估计方法无延迟,非常适合在线应用。
间歇发酵放罐时机的准确识别对提高产量和产率,降低能耗和成本有实际意义。有学者利用在线检测的尾气CO2变化率、DO 变化率,辅以离线检测的总糖浓度变化率、氨基氮浓度变化率及pH,并根据某抗生素生产数据,建立了该发酵过程放罐时机识别与预报模型及计算机实时识别系统。5批实验表明模型判断比人工更及时,且模型判断的产量对于发酵终点的相对值高于人工判断。
4、优化供氧 对于好氧发酵,为确保生产菌获得适量的溶氧,将溶氧控制在临界氧浓度之上即可。这样既避免了细胞因供氧不足发生代谢异常,也可避免过度供氧引起的能量消耗和对细胞可能的伤害。根据 OUR 的变化可以很方便确定临界氧浓度。其原理是:当发酵罐在一定操作系统下,体积传氧系数Kla 保持恒定时,随着 OUR 上升,DO 呈下降趋势,当 OUR 下降,则 DO 上升,OUR 与DO 存在相反的变化趋势。而当 DO 降到临界氧浓度以下时,OUR 随 DO 的下降而下降。由于发生在此变化的时间内,菌体浓度变化可忽略,OUR 的变化可看作是呼吸强度(即比耗氧速率)的变化。所以如果存在 OUR与 DO 变化一致的阶段,即为溶解氧低于临界值的阶段,从而可确定此时的临界氧水平。
有学者在30L发酵罐上研究了必特螺旋霉素基因工程菌发酵中OUR、CER及DO等参数变化的相关性,发现当 DO 与 OUR 的趋势具有相反性时,限制因素为细胞水平的菌体代谢问题;若DO 与 OUR 的趋势具有同一性,限制性因素为工程水平的氧传递因素,表明溶氧处于临界氧以下;并据此判断发酵前期临界氧浓度应在25%,为其发酵放大工艺研究提供了依据
通气量的调节很多是凭借经验。在安装溶氧电极时可根据临界氧来调控。研究发现在阿维菌素发酵中用尾气数据进行通气量控制,发现在产素期当通气量由 1600m3/h降到1400m3/h 时,CER、OUR 立即开始下降,RQ则是先升后降,说明供氧对代谢的限制已经显现。后来测定的产素速率也在此时下降。以此确定产素期通气量临界值为1600m3/h。
5、指导流加补料 流加发酵可在系统中维持很低的基质浓度,从而避免发生阻遏效应,并按设备能力维持适当供氧,减缓代谢有害物的不利影响。因而可对发酵过程进行控制,提高生产水平。利用尾气在线检测分析可以合理控制流加时间、流加速率,进而实现流加的反馈控制。有学者根据多批青霉素生产测得的CER,采用模糊控制技术,在青霉素生产期将CER作为控制参数进行补糖。该控制算法能针对菌丝的瞬间代谢情况流加糖,使菌丝对糖的利用能力大大加强,效率提高了10%左右。
固定化酵母发酵中,载体的存在使葡萄糖扩散受阻。如不能对糖浓度变化快速反应,载体中的细胞就会出现缺糖现象。这种体系的特殊性也很难用估计糖浓度的方法来进行预测。有学者利用CER 和CO2释放量来估计载体内菌体对糖的饥饱程度,从而控制葡萄糖流加速率,使乙醇连续平稳地生产,平均转化率为 0.42g 乙醇/g 葡萄糖。
6生物量预测及预估 CER 是呼吸代谢参数,与生物生长有密切联系,可用来估计生物质浓度和产物浓度。而且这种估计的是反应活性生物质浓度或产物浓度,排除了培养基固体成分和死细胞的干扰。研究发现在 800 L 反应器上,利用在线的 CER数据估计前期的菌体生长量,并且取得良好的对应关系。在50 m3谷氨酸发酵罐上利用 CER 在线估算菌体量,并实测数据进行校正,使估算值接近实际值,同时运用先进的过程控制策略,对谷氨酸发酵的主要参数进行控制,运行后糖转化率稳定提高,产酸率提高1.5%。
固态发酵已广泛应用于生物农药、饲料等行业,但生物量的测定是面临的问题。在液态发酵容易做到的生物量离线测定,在此也因无法使菌体与培养基分离难以获得。利用CO2在线检测是比较有效的方法。研究者在木霉T6固态发酵产淀粉酶及产木聚糖酶中,分别研究了CO2与淀粉酶及木聚糖酶活力的关系,发现尾气中CO2浓度曲线与比淀粉酶活力曲线变化一致,且同时达到最大值;而木聚糖酶的合成与CO2含量之间存在滞后关系,CO2浓度在发酵26h达到最高值,木聚糖酶活力在39h才达到峰值。说明尾气CO2含量变化可以作为固态发酵某些产物合成的研究参数。
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