发酵液下游处理过程

王中泰

发酵液下游处理过程 （上）

发酵下游工艺是指从发酵液或酶反应液中分离纯化出目的产物的过程。发酵液中所含目的产物的浓度较低，成分复杂，稳定性差，因此下游处理工艺的作用条件要温和，操作速度要快，尽量减少工艺步骤，降低损耗。目的产物多种多样，如菌体、胞外产物、胞内产物等，不同的目的产物性质不同，要根据产物性质针对性地选择处理方法，进行分离纯化。下游加工一般分为五个阶段：发酵液预处理、固液分离、产物提取、产物精制和成品加工。

一、发酵液预处理

对发酵液进行适当的预处理可增大悬浮液中固体粒子的尺寸，除去高价无机离子和杂蛋白质，降低液体黏度，提高过滤与分离的速率。预处理的方法有加热、凝聚和絮凝、加吸附剂或盐类、调节pH、加入助滤剂等。

1、加热
在适当的温度和受热条件下，蛋白质会变性，并凝聚形成大颗粒的凝聚物，降低液体黏度，提高过滤效率。使用加热法时必须严格控制加热温度和时间，否则可能会导致细胞溶解，影响目的产物的活性。

2、凝聚和絮凝
发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等常带负电荷，由于静电引力的作用，使溶液中带相反电荷的阳离子被吸附在其周围，在界面上形成双电层。这种双电层的电位越高，电排斥作用越强，胶体粒子的分散程度也就越大，发酵液过滤就越困难。

凝聚作用就是向发酵液中加入某种电解质，在电解质的异电离子作用下，胶粒的双电层电位降低，使胶粒体系不稳定，胶体离子间因相互碰撞而产生聚集的现象。絮凝则是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。

3、加入盐类
高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe3+）存在会影响离子交换法分离时，树脂的交换容量。发酵液中加入盐类，可除去某些高价无机离子，如常采用草酸钠或草酸，生成草酸钙沉淀，去除钙离子。

4、调节pH
蛋白质属两性物质，在等电点时，净电荷为零，此时溶解度最小。因此，调节发酵液的pH到蛋白质的等电点可有效除去蛋白质。

5、加入助滤剂
在含有大量细小胶体粒子的发酵液中加入固体助滤剂，胶体粒子会被吸附到助滤剂微粒表面，助滤剂作为胶体粒子的载体，均匀地分布于滤饼层中，相应地改变了滤饼结构，降低了滤饼的可压缩性，减小了过滤阻力。

二、固液分离

1、离心
在离心力作用下，不同密度或体积的物质具有不同的沉降速度，从而实现分离。离心分离设备分为两类：一类是过滤式离心分离设备，分离操作的推动力为惯性离心力，常采用滤布作为过滤介质；另一类是沉降式离心分离设备，常用的离心机有管式离心机和碟式离心机两种。

2、过滤
依据过滤介质的孔隙大小，对溶质进行分离。所用设备有板框式及板式压滤机、真空过滤机等。

三、产物提取

若提取细胞内的发酵产物，则还需进行细胞破碎。细胞破碎是指选用物理、化学、酶的方法来破坏细胞壁或细胞膜，使产物从胞内释放到周围环境的过程。常用的设备有超声破碎仪、均质机等。

1、离子交换
离子交换法主要是基于一种合成的离子交换剂作为吸附剂，以吸附溶液中需要分离的带电粒子，从而将不同带电粒子分离的方法。
生物工业中最常用的交换剂为离子交换树脂，其广泛用于提取氨基酸、有机酸、抗生素等小分子生物制品。在提取过程中，发酵液中的目的产物吸附在离子交换树脂上，然后在适宜的条件下用洗脱剂将吸附物从树脂上洗脱下来，达到分离、浓缩、提纯的目的。

2、萃取
（1）溶剂萃取
溶剂萃取，即液-液萃取，是一种利用溶质在两种互不相溶的溶剂中的溶解度不同达到分离目的的方法。溶剂萃取有分离程度高，生产能力大，周期短，连续化自控操作等优点。
萃取分为三个步骤：
①混合：料液和萃取剂充分混合形成乳状液，使溶质自料液中转入萃取剂中；
②分离：将乳状液分为萃取相和萃余相
③溶剂回收

图1溶剂萃取过程

（2）反胶束萃取
反胶束是利用表面活性剂在非极性有机溶剂中包裹水滴，悬浮在有机相中形成反胶团，其可在有机相内形成分散的亲水微环境，又称为反胶团、逆胶束。

图2反胶束萃取过程


（待续）

参考资料：
[1]朱明军.生物工程设备[M].北京：中国轻工业出版社,2021.12

王中泰

发酵下游工艺（下）

反胶束体系对料液中极性分子的萃取过程：溶有表面活性剂的疏水溶剂和料液直接接触，主要极性产物在表面活性剂极性头的静电力作用下，进入反胶束极性核内部，并最终被萃取至疏水相，而其他杂质由于与表面活性剂的作用力，仍然保留在水相料液，从而使主要极性产物得以分离和纯化。

（3）双水相萃取
当两种亲水性溶剂或一种亲水性溶剂与一种盐在水中以一定浓度混合时，可形成互不相溶的两相，其中一相富含一种亲水性溶剂，一相富含另一种亲水性溶剂或盐，这种两相体系可称之为双水相体系。

常用的双水相体系是PEG/无机盐体系，主要应用于胞内酶提取。细胞破碎而制得的料液黏度大，细胞碎片小，分离困难。采用双水相系统可使欲提取的酶与细胞碎片以较大的分配系数分配在不同的相中，进而采用离心法就可实现分离。因而一步操作即可达到固液分离和纯化两个目的。

（4）超临界流体萃取超临界流体是指温度和压力略超过或靠近临界温度和临界压力介于气体和液体之间的流体。超临界流体萃取即是利用超临界流体作为萃取剂，依靠被萃取的物质在不同蒸汽压力下所具有的化学亲和力和溶解能力不同，从固体或液体中萃取某种高沸点或热敏性成分，以达到分离纯化的目的。因此超临界流体萃取同时具有液相萃取和精馏的特点，效率高，溶剂回收简单。

3、膜过滤
膜过滤是以膜两侧的压力差为推动力，利用膜孔径的选择透过性使离子、小分子通过，颗粒及生物大分子被截留，实现物质分离。常见的膜分离过程有透析、电渗析、微过滤、超滤等。

电渗析是利用阴阳离子交换膜的选择透过性和膜两侧的电势差进行分离的方法，阳离子可以穿过阳离子交换膜向阳极室方向移动，阴离子可以穿过阴离子交换膜向阴极室方向移动，使料液中的盐类被脱除。

超滤是利用铝膜能透过小分子物质的特性，在加压条件去除部分溶剂，用于粗分离、脱盐，可无菌连续或批式操作，适用性好，但滤膜易污染。

4、吸附分离
吸附法是利用合适的吸附剂，在一定的操作条件下，使发酵液中的产物吸附在固定吸附剂的内外表面上，再以适当的解吸剂从吸附剂上解吸下来，从而达到分离浓缩的目的。常用于脱色、除臭、分离溶液中有机物等。

吸附的操作方式主要有两种：一种为搅拌罐内的吸附，即吸附主要在搅拌容器内进行，使吸附剂与溶剂均匀混合，充分接触，促使吸附的进行；另一种是吸附剂在容器中形成床层，溶液从床层流过时被吸附，床层可以是固定床或移动床，操作方式多采用间歇式，也有采用多级串联式。

四、产物精制
1、色谱分离

色谱分离是利用不同物质物理化学性质存在差别，因此不同程度分布在两个相中。其中一个相为固定相，通常为表面积很大或多孔的固体；另一相为流动相，是液体或气体（分别称为液相色谱和气相色谱）。当流动相流过固定相时，由于各组分在两相间的分配情况不同，使易分配于固定相中的物质移动速度慢，而易分配于固定相中的物质移动速度慢，而易分配于固定相中的物质移动速度慢，而易分配于流动相中的物质移动速度快，从而达到逐步分离的目的。

图3 色谱分离过程（

色谱分离的分离效果高，应用范围广，选择性强，分离快速。

2、结晶
结晶是将高浓度的溶液或过饱和溶液缓慢冷却，使溶质慢慢形成晶体析出的过程，能从杂质含量相当多的溶液或多组分的熔融混合物中分离出高纯或超纯的晶体。结晶设备根据改变溶液浓度的方法分为浓缩结晶设备、冷却结晶设备、等电点结晶设备。

五、成品加工

干燥操作通常是固体生物产品（如柠檬酸、谷氨酸、酶制剂、单细胞蛋白等）生产过程中的最后一道工序。干燥使目的产物的湿分降低到规定的范围内，不仅易于包装和运输，更重要的是生物产物干燥后更稳定，不易变质，便于贮存。常用的干燥方法有对流干燥（包括固定床干燥、流化床干燥、气流干燥、喷雾干燥）、冷冻干燥、真空干燥、微波干燥和红外干燥等。


参考资料：

[1]朱明军.生物工程设备[M].北京：中国轻工业出版社,2021.12