生物实验常用溶液的配制

王中泰

生物实验常用溶液的配制

一、 DNA 电泳相关：

1 、 DNA 电泳缓冲液：

（ 1 ） Tris- 乙酸（ TAE ）缓冲液： TAE 较为常用，且价格低，但其缓冲能力较弱。所以 TAE 电泳需要蠕动泵使两极贮液槽进行液体循环，而且 TAE 需要经常更新；且要加入 EDTA ，目的在于鳌合二价离子，抑制 DNase ，以保护 DNA 。

① TAE 使用液：

1× ： 40mmol/L Tris- 乙酸

1mmol/L EDTA

② TAE 贮存液（每 L ）：

50× ： 242g Tris 碱

57.1ml 冰乙酸

100ml0.5mol/L EDTA （ pH8.0 ）

（ 2 ） Tris- 硼酸（ TBE ）缓冲液：

① TBE 使用液：

0.5× ： 0.045mol/L Tris- 硼酸

1mmol/L EDTA

② TBE 贮存液（每 L ）：

5× ： 54g Tris 碱

27.5ml 硼酸

20ml0.5mol/L EDTA （ pH8.0 ）

（ 3 ） Tris- 磷酸（ TPE ）缓冲液：

① TPE 使用液：

1× ： 90mmol/L Tris- 磷酸

2mmol/L EDTA

② TPE 贮存液（每 L ）：

10× ： 108g Tris 碱

15.5ml 85% 磷酸

40ml0.5mol/L EDTA （ pH8.0 ）

2 、 1% （线性 DNA 分子大小为 400-6000 ）琼脂糖凝胶 DNA 电泳操作过程：

①制胶：按要求取 1g 琼脂糖加入 1 × TAE （或 0.5 × TAE ）电泳缓冲液 100ml ，置于三角瓶中，在沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖溶解（一般中低火温， 3-5min 即可）；

②溶液冷却至 60 ℃，加入 EB 至 0.5 μ g/ml （ 2-3ml 即可） , 充分混匀；

③迅速倒入备好的胶模中；

④凝胶完全凝固后，小心移去梳子和封口胶带，将凝胶放入电泳槽中；

⑤加入能没过胶面 1mm 深的电泳缓冲液（ TAE ）；

⑥ DNA 样品与加样缓冲液（溴酚蓝）混合后，用微量移液吸头加样；

⑦盖上电泳槽并通电，使 DNA 向正极移动（黑极→红极）， 1-5V/cm （ 80V 电压左右）进行电泳（ 30min 左右）；

⑧电泳完毕，切断电源，取出凝胶于紫外投射光源下观察并拍照。

二、 12 ％ SDS-PAGE 的相关溶液

1 、 5× 加样缓冲液：

10% w/v SDS ， 10 mM DTT 或 β- 巯基乙醇， 20% v/v 甘油， 0.2M Tris-HCl pH 6.8 ， 0.05% w/v 溴酚蓝。 （注意：将不含 DTT 的 1 × SDS 凝胶上样缓冲液置于室温下储存，临用前从 1mol/L DTT 储液中添加到上述缓冲液中。）

5×Sample Buffer ：

10%w/v SDS

10mmol/L Dithiothreitol,orbeta-mercapto-ethanol

20%v/v Glycerol

0.2mol/L Tris-HCl pH6.8

0.05%w/v Bromophenolblue

另： 2 × SDS 上样液缓冲液 :

100mL 溶液中含 0.5mol/L Tris-HCl(pH=6.8) 20mL , SDS 4 g , 甘油 20 mL , 溴酚蓝 0.2 g ,DTT3g;

2 、 1× 电泳缓冲液：

25 mM Tris-HCl pH8.8 ， 200 mM 甘氨酸， 0.1% w/vSDS 。

1×Running Buffer

25mmol/L Tris-HClpH 8.8

200 ～ 250mmol/L Glycine （电泳级）（ pH 8.3 ）

0.1%w/v SDS

可以配成 5× 贮存液，在 900ml 去离子水中溶解 15.1gTris 碱和 94g 甘氨酸，然后加入 50ml 10% （ m/v ）电泳级 SDS 的贮存液，用去离子水补至 1000ml 即可。

3 、分离胶配方：

H2O 10.5 ， 1.5 M Tris-HCl pH8.8 7.5 ， 20% w/v SDS 0.15 ， 30% 丙烯酰胺 / 0.8% 亚甲双丙烯酰胺 (/w/v) 12.0 ， 10% w/v 过硫酸铵 15 ， TEMED 0.02 （单位： mL ，总体积 25 mL ）。 注：过硫酸铵会缓慢分解，故应每周新鲜配制，可用去离子水配制少量 10% （ m/v ）储存液于 4 ℃保存。

Running GelSolution (mL) ：

H2O 10.2

1.5 mol/LTris-HClpH8.8 7.5

20% SDS(w/v) 0.15

Acrylamide/Bis-acrylamide(30%/0.8%w/v) 12.0

10% ammoniumpersulfate(w/v) 0.15

TEMED 0.02

4 、积层胶配方 (4% 丙烯酰胺 ) ：

H2O 3.05 ， 0.5 M Tris-HCl pH6.8 1.25 ， 20% w/v SDS 0.025 ， 30% 丙烯酰胺 / 0.8% 亚甲双丙烯酰胺 (/w/v) 0.65 ， 10% w/v 过硫酸铵 0.025 ， TEMED 0.005 （单位： mL ，总体积 5 mL ）。

Stacking GelSolution (4% Acrylamide) (mL) ：

H2O 3.075

0.5 mol/LTris-HClpH6.8 1.25

20% SDS(w/v) 0.025

Acrylamide/Bis-acrylamide(30%/0.8%w/v) 0.67

10% ammoniumpersulfate(w/v) 0.025

TEMED 0.005

5 、考马斯亮蓝染色液：

0.25 g 考马斯亮蓝 R250 溶解于 90 mL 甲醇：水（ 1:1 v/v ）和 10 mL 冰乙酸的混合液中，过滤除去颗粒状物质。（或考马斯亮蓝 R-250 0.5g , 乙醇 250mL , 乙酸 110mL , 水 740mL , 混匀 ; ）

另： 0.2 ％考马斯亮兰 R-250 染液：

甲醇 46.5ml

醋酸 7.0ml

考马斯亮兰 0.2g

蒸馏水 加至 100ml

6 、脱色液：

170 mL 甲醇 , 加 70 mL 冰乙酸，加蒸馏水定容至 1000 mL 。

王中泰

三、蛋白质纯化的相关溶液

1 、超声破菌缓冲液：

20 mmol/L Tris-HClpH8.0 、 0.5 mol/L NaCl 、 1 mmol/L EDTA 、 1 mg/mL 溶菌酶

2 、包涵体洗涤缓冲液：

20 mmol/L Tris － HCl pH 8.0 ， 0.5 mol/L NaCl ， 2 mol/L 尿素， 2 ％ Triton 。

3 、包涵体溶解缓冲液：

20 mmol/L Tris － HCl pH 8.0 ， 0.5 mol/L NaCl ， 8 mol/L 尿素， 0.2 mmol/L DTT 或 100 mmol/L β- 巯基乙醇， 2 ％ Triton 。

4 、 Ni2+ 亲和层析柱纯化缓冲液：

Reagents	Binding Buffer	Wash Buffer	Elute Buffer	Strip Buffer	Charge Buffer
Tris-HCl pH7.9	20 mM	20 mM	20 mM	20 mM
Imidazole	5 mM	60 mM	1M
NaCl	0.5 M	0.5 M	0.5 M	0.5 M
EDTA				100 mM
NiSO4					50 mM

结合缓冲液（ pH7.8 ）：

20mmol/L 磷酸钠

500mmol/L NaCl

洗涤缓冲液（ pH6.0 ）：

20mmol/L 磷酸钠

500mmol/LNaCl

咪唑洗脱缓冲液（ pH6.0 ）：

20mmol/L 磷酸钠

500mmol/L NaCl

在洗涤缓冲液（ pH6.0 ）中加入适量 3mol/L 咪唑分别配成 10mmol/L 、 50mmol/L 、 100mmol/L 和 150 mmol/L 的咪唑洗脱缓冲液。

Triton X-100(10%v/v)

酶和缓冲液：

DNase(1mg/ml)

溶菌酶

RNase(1mg/ml)

5 、 2 ％ Triton X － 100 溶液：

量取 2mlTriton X 一 100( 聚乙二醇辛基苯基醚 ) 液，加 M 缓冲液 98ml 即可。

6 、 50 ％ PEG( 聚乙二醇 Polyethyleneglycol mwl500) ：

称取 0.5 克 PEG ，用前放入试管中在酒精灯火焰上熔化，加入等量 37 ℃予热的 MEM 培养液，混匀，保温在 37 ℃水浴中待用。

7 、 1 ％ SDS( 十二烷基硫酸钠 Sodium dodecyl sulfate,SDS) ：

SDS 10g

45 ％乙醇 100ml

8 、 1mol/LTris( 三羟甲基氨基甲烷 / 盐酸缓冲液 Trihydroxy methylaminomethane Tris/HCL)pH7.8 ：

Tris 12.114g

蒸馏水 lOOml

先将 Tris 溶于少量蒸馏水，用 HCI 调 pH 至 7.8 ，然后加水至 100ml

四、 PH 缓冲液的配制：

（ 1 ）磷酸缓冲盐溶液（ PBS ）：

① 137mmol/L NaCl

2.7mmol/L KCl

10mmol/L Na2HPO4

2mmol/L KH2PO4

用 800ml 蒸馏水溶解 8g NaCl ， 0.2g KCl ， 1.44g Na2HPO4 和 0.24g KH2PO4 。用 HCl 调节溶液的 PH 值至 7.4 ，加水至 1L 。分装后在 15psi （ 1.05kg/cm2 ）高压蒸汽灭菌 20min ，或过滤除菌，保存于室温。（注： PBS 是一种通用试剂，值得指出的是上述列出的配方缺乏双价阳离子，如果需要， PBS 可以补加成 1mmol/L CaCl2 和 0.5mmol/L MgCl2 ）

② 0.01mol ／ LPBS( 磷酸盐缓冲液 Phosphate Buffer Saline ， PBS) ， pH7.2 ：

A ： 0.2mol ／ L 磷酸氢二钠液 ( 甲液 ) ：

NaH2PO4·12H2O 35.814g

双蒸水 加至 500ml

B ： 0.2mol ／ L 磷酸二氢钠液 ( 乙液 ):

NaH2PO4·2H2O 15.601g

　　双蒸水 加至 500ml

取甲液 36ml ，乙液 14ml 和 NaCl 8.2 克，加双蒸水至 1000ml 。混匀待完全溶解分装，经高压灭菌后保存于 4 ℃冰箱备用。

③ 1/15 mol/L PBS( 磷酸缓冲液 Phosphate Buffer Solution ， PBS) ：

甲液： 1/15 mol/L Na2HPO4 溶液

Na2HPO4 9.465g

蒸馏水 加至 1000ml

乙液： l/15 mol/L KH2PO4 溶液

KH2P04 9.07g

蒸馏水 加至 1000m1

分装在棕色瓶内，于 4 ℃冰箱中保存，用时甲、乙两液各按不同比例混合，即可得所需 pH 的缓冲液 , 见下表 :

pH	甲液 ml	乙液 ml	pH	甲液 ml	乙液 ml
4.92 5.29 5.59 5.91 6.24 6.47 6.64 6.81	1.0 2.5 5.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0	99.0 97.5 95.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0	6.98 7.17 7.38 7.73 8.04 8.34 8.67 8.18	60.0 70.0 80.0 90.0 95.0 97.5 99.0 100.0	40.0 30.0 20.0 10.0 5.0 2.5 1.0 0

王中泰

（ 2 ） 10 × Tris EDTA(TE):

① pH 7.4:

100mmol/LTris-Cl(pH7.4)

10mmol/L EDTA(pH8.0)

② pH 7.6:

100mmol/LTris-Cl(pH7.6)

10mmol/LEDTA(pH8.0)

③ pH 8.0:

100mmol/LTris-Cl(pH8.0)

10mmol/LEDTA(pH8.0)

分装后在 15psi （ 1.05kg/cm2 ）高压蒸汽灭菌 20min ，保存于室温。

（ 3 ） Tris-Cl （ 1mol/L ） :

用 800ml 蒸馏水溶解 121.1gTris 碱，加浓盐酸调 pH 至所需值。

pH HCl

7.4 70ml

7.6 60ml

8.0 42ml

应使溶液冷至室温后，方可最后调定 pH 值。加水定容至 1L 。分装后高压蒸汽灭菌。如果 1mol/L 溶液呈现黄色，应予丢弃。并使用雷竞技百科 更好的 Tris 。 Tris 溶液的 pH 值因温度而异，温度每升高 1 ℃， pH 值大约降低 0.03 单位， 0.05mol/L 溶液在 5 ℃， 25 ℃和 37 ℃时的 pH 值分别为 9.5 ， 8.9 和 8.6 。

（ 4 ） Tris 缓冲盐溶液（ TBS ）：

用 800ml 蒸馏水溶解 8g NaCl ， 0.2g KCl 和 3g Tris 碱，加入 0.015g 酚红并用 HCl 调 pH 值至 7.4 ，用蒸馏水定容至 1L 。分装后在 15 psi （ 1.05 kg/cm2 ）高压下蒸汽灭菌 20min ，保存于室温。

五、常用缓冲液配制：

（ 1 ）碳酸钠 - 碳酸氢钠缓冲液

贮备液 A ： 0.2 mol/L 碳酸钠（ Na2CO3·H2O 24.8g 配成 1000ml ）；

贮备液 B ： 0.2 mol/L 碳酸氢钠（ NaHCO3 16.8g 配成 1000ml ）。

x ml A 液 + y ml B 液稀释至 200ml

pH	x	y	pH	x	y
9.2	4.0	46.0	10.0	27.5	22.5
9.3	7.5	42.5	10.1	30.0	20.0
9.4	9.5	40.5	10.2	33.0	17.0
9.5	13.0	37.0	10.3	38.5	14.5
9.6	16.0	34.0	10.4	38.5	11.5
9.7	19.5	30.5	10.5	40.3	9.5
9.8	22.0	28.0	10.6	42.5	7.5
9.9	25.0	25.0	10.7	45.5	5.0

（ 2 ）磷酸二氢钠 - 磷酸氢二钠缓冲液

贮备液 A ： 0.2 mol/L 磷酸二氢钠（ NaH2PO3·H2O 27.6g 或 NaH2PO3·2H2O 31.21g 配成 1000ml ）；

贮备液 B ： 0.2 mol/L 磷酸氢二钠（ Na2HPO3·2H2O 35.61g 或 Na2HPO3·12H2O 71.64g 配成 1000ml ）。

x ml A 液 + y ml B 液稀释至 100ml

pH	x	y	pH	x	y
5.7	93.5	6.5	6.9	45.0	55.0
5.8	92.0	8.0	7.0	39.0	61.0
5.9	90.0	10.	7.1	33.0	67.0
6.0	87.7	12.3	7.2	28.0	72.0
6.1	85.0	15.0	7.3	23.0	77.0
6.2	81.5	18.2	7.4	19.0	81.0
6.3	77.5	22.5	7.5	16.0	84.0
6.4	73.5	26.5	7.6	13.0	87.0
6.5	68.5	31.5	7.7	10.0	89.0
6.6	62.5	37.5	7.8	8.5	91.5
6.7	56.6	43.5	7.9	7.0	93.0
6.8	51.0	49.0	8.0	5.3	94.7

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（ 3 ） Tris-HCl 缓冲液

贮备液 A ： 0.2 mol/L 三羟甲氨基烷（ Tris-ydroxy methyLamino methanne,C4H11NO3 ， 24.2g 配成 1000ml ）；

贮备液 B ： 0.2 mol/L 盐酸（浓 HCl 17.1ml 配成 1000ml ）。

50ml ml A 液 + x ml B 液稀释至 200ml

pH	x	pH	x	pH	x
7.2	44.2	8.0	26.8	8.8	8.1
7.1	41.4	8.2	21.9	9.0	5.0
7.6	38.4	8.4	16.5
7.8	32.5	8.6	12.2

（ 4 ）柠檬酸 - 柠檬酸钠缓冲液

贮备液 A ： 0.1 mol/L 柠檬酸（ C6H8O7 ， 19.21g 配成 1000ml ）；

贮备液 B ： 0.1 mol/L 柠檬酸钠（ C6H5O7Na3·2H2O 29.41g 配成 1000ml ）。

x ml A 液 + y ml B 液稀释至 100ml

pH	x	y	pH	x	y
3.0	46.5	3.5	4.8	23.0	27.0
3.2	43.7	6.3	5.0	20.5	29.5
3.4	40.0	10.0	5.2	18.0	32.0
3.6	37.0	13.0	5.4	16.0	34.0
3.8	35.0	15.0	5.6	13.7	36.3
4.0	33.0	17.0	5.8	11.8	38.2
4.2	31.5	18.5	6.0	9.5	40.5
4.4	28.0	22.0	6.2	7.2	42.8
4.6	25.5	24.5

（ 5 ）醋酸 - 醋酸钠缓冲液

贮备液 A ： 0.2 mol/L 醋酸（冰醋酸 11.55ml 稀释至 1000ml ）；

贮备液 B ： 0.2 mol/L 醋酸钠（ C2H2O2Na 16.4g 或 C2H2O2Na·3H2O 27g 配成 1000ml ）。

x ml A 液 + y ml B 液稀释至 1000ml

pH	x	y	pH	x	y
3.6	46.3	3.7	4.8	20.0	30.0
3.8	44.0	6.0	5.0	14.8	35.2
4.0	41.0	9.0	5.2	10.5	39.5
4.2	36.8	13.2	5.4	8.8	41.2
4.4	30.5	19.5	5.6	4.8	45.2
4.6	25.5	24.5

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六、细胞培养和细胞融合溶液：

1 、 0.25 ％胰蛋白酶 -0.02 ％ EDTA 混合消化液：

胰蛋白酶 (Trypsin) 粉 0.25g

EDTA 粉 20.0mg

0.01mol ／ LPBS 100ml

先用少量 PBS 溶解胰蛋白酶，然后将 EDTA 粉末和剩下的液体加入混合，置 37 ℃水浴中 1 小时左右 ( 待彻底溶解，液体呈透明为止 ) ，用 G5 抽滤，分装置 4 ℃冰箱中保存。

2 、 Hanks 液：

（ 1 ）原液

①原液甲：

NaCl 160g

KCl 8g

MgSO4·7H2O 2g

MgCI2·6H2O 2g

溶于 800ml 馏水中。

CaCl2( 无水 ) 2.8g

溶于 100ml 蒸馏水中。

将两种液体混合后，加水至 1000ml 用滤纸滤过，再加 2ml 氯仿防腐，置 4 ℃冰箱备用。

②原液乙：

Na2HPO4·12H2O 3.04g

KH2PO4 1.2g

葡萄糖 20.0g

溶于 800ml 蒸馏水中，用滤纸过滤，然后加 0.5 ％酚红 80ml ，再加水至 1000ml ，最后加入 2ml 氯仿防腐，置 4 ℃冰箱备用。

（ 2 ）使用液

甲乙两液各 1 份，双蒸水 18 份，混匀分装包扎好瓶口，经 10 磅 15 分钟高压灭菌后置 4 ℃冰箱中保存。使用时用 5.6 ％ NaHCO3 调 pH 值到所需要求。

3 、 LB 培养基（ Luria-Bertani 培养基）：

每升培养基含有：

细菌培养用胰化蛋白胨（ bacto-trytone ） 10g

细菌培养用酵母提取物（ bacto-yeast extract ） 5g

氯化钠（ NaCl ） 10g

在 950ml 重蒸水中分别加入上述组分，摇动容器直至溶质完全溶解，用 5mol/L 氢氧化钠（ NaOH ）（约 0.2ml ）调节 pH 值至 7.0 ，加入重蒸水定容至 1L ，在 1.034 × 105Pa 高压蒸汽灭菌 20min 。（液体培养基）

另：固体培养基（含有琼脂或琼脂糖的培养基）

按照上述配方配制液体培养基，高压灭菌前加入下列试剂中的一份：

细菌培养用琼脂（ Bacto-Agar ） 15g/L( 铺制平板用 )

细菌培养用琼脂（ Bacto-Agar ） 7g/L( 配制顶层琼脂用 )

琼脂糖 15g/L( 铺制平板用 )

琼脂糖 7g/L( 配制顶层琼脂用 )

在 15psi （ 1.05kg/cm2 ）高压下灭菌 20min 。从高压锅取出培养基时应轻轻旋动以使溶解的琼脂或琼脂糖能够均匀分布在整个培养基溶液中。必须小心，此时培养基溶液可能过热，旋动液体可能会发生暴沸。应使培养基降温至 50 ～ 60 ℃，方可加入不耐热的物质（如抗生素，加 Amp 的量为 1:100 ）；为避免产生气泡，混匀培养基时应采用旋动的方式。然后可直接从烧瓶中倒置平板。 90mm 直径的培养皿每个需约 30 ～ 50ml 的培养基。如果平板上的培养基有气泡形成，可在琼脂或琼脂糖凝结前用本生煤气喷射灯灼烧培养基表面以除去之。设定颜色记号在相应平板的边缘作记号以区别不同的培养基。

培养基完全凝固后，应倒置平板并贮存于 4 ℃备用。使用前 1-2h 应取出贮存的平板。如果平板是新鲜配制的，在 37 ℃温育时会“发汗”，便会导致细菌菌落或噬菌体噬菌斑在平板表面扩散而增加交叉污染的机会。为避免这一问题，可以拭去平皿内部的冷凝水并把平板倒置， 37 ℃温育数小时方予使用，也可以快甩一下平皿以除去冷凝水，为尽可能减少污染，除去盖上的水滴时，应把开盖的平板呈倒置状态拿着。

4 、 Amp ：抗生素（氨苄青霉素），浓度 50mg/ml （溶于水），温度 -20 ℃，工作液（严密型质粒： 20 μ g/ml ；松弛型质粒 60 μ g/ml ）

5 、 IPTG ： isopropyl-β-D-thiogalactoside( 异丙基 -β-D- 硫代半乳糖苷 ) ，作为蛋白质诱导剂。母液 1M/L ，工作液 1mM/L

yujiansp

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