色谱柱子干枯，主峰易分叉？问题竟出在滤膜上！

王中泰

色谱柱子干枯，主峰易分叉？问题竟出在滤膜上！

不知道大家有没有遇到过这样恼火的事情——刚刚购买的色谱柱，进样不到20针，主峰竟然分叉！！而且，不管如何洗脱都无法恢复......

浪费资金不说，还严重影响实验进度。


咨询工程师归结原因为样品太脏，造成筛板塌陷。


难道滤膜选择有问题？
心塞啊！孰是孰非已说不清楚。


唯有继续严谨把控样品前处理，保护色谱柱和液相进样系统。

对于分析工作来说，样品前处理是必不可少的环节，同时也是一项技术性工作。


不管超声，还是振荡，保证主药溶解以后，都要进行过滤再进入液相系统。


其中滤膜的作用至关重要。今天我们就来818滤膜的事情。


为什么要拿这么简单的滤膜选择的事情出来讲，有一个至关重要的原因，哪个新手没有因为滤膜毁掉一次实验。。。

1.有机试剂一不小心用了水系膜。结果差点把某些杂峰给当成未知杂质。。。


2.做溶出，滤膜孔径不合适，结果取出来的样滤不过去。。手忙脚乱重新找膜差点耽误一整锅溶出。。。


3.不做滤膜吸附试验，差点以为原研的溶出不合格。。。


所以，在试验开始之前大家都先把这篇文发给新手看一下！

滤膜最重要的功能是啥？
答：
分析系统的大门，保护作用！微孔滤膜是利用高分子化学材料，致孔添加剂经特殊处理后涂抹在支撑层上制作而成。主要用于色谱分析中流动相及样品的过滤，对保护色谱柱及输液泵管系统和进样阀等不被污染具有良好的作用。

1.过滤以后的溶剂和样品，会对色谱柱和液相进样系统起到保护作用。
对色谱柱的影响：由于填料颗粒很细，色谱柱内空隙极小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和筛板堵塞。对液相进样系统的影响：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。

2.消除由于污染对分析结果的影响。
对于常用的紫外检测器和二极管阵列检测器，如果样品浓度比较低，颗粒会造成噪声比较大，基线不稳，感染正常信号，影响检测结果。

常用滤膜类型
常用滤膜分为水系和有机系两种。

水系膜
水系滤膜通常为混合纤维素酯滤膜，使用前常需进行水浸处理，防止滤膜使用时未压紧有气泡入内，同时水浸可以使膜充分溶胀。

有机膜
有机系滤膜有尼龙滤膜、聚偏氟乙烯滤膜、聚四氟乙烯滤膜等，使用前不需预先湿润，几乎能与全部溶出介质相容。使用过程中，根据所过滤样品选择合适的滤膜。
聚四氟乙烯膜（PTFE）/聚偏氟乙烯膜（PVDF）：
惰性较强，适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。


尼龙滤膜（N6、N66）：
通用型，满足纯水样品和水/有机混合样品。适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%乙醇，二氯甲烷，不适用于二甲基甲酰胺。

再生纤维素膜（RC）：
适用于水溶性样品和有机溶剂。


聚醚砜滤膜（PES）：
适用于水溶性样品的过滤，不适用于酮类、酯类、油类等极性溶液及高浓度的酸溶液。


混合纤维素酯膜（WX）：
适用于水溶液，不耐酸、碱、有机溶剂。


偏氟膜（F膜）：
适用于有机溶剂及空气过滤，可用于有机溶剂除微粒，提高试剂级别等。

如何选择滤膜
对于滤膜选择主要从材质和孔径两方面来来考虑：


材质的筛选
有机系滤膜：
用于有机相或者有机相溶液的过滤，如过滤水溶液错选了有机膜，会导致过滤流速极低或者干脆无法过滤。


水系滤膜：
只能过滤水溶液，过滤有机相溶液时，滤膜会溶解掉，溶有滤膜的溶剂会对液相仪器以及色谱柱造成严重损伤。


水/有机混合流动相的过滤，首选有机相滤膜。


如果混合流动相中有机相的比例偏少，可先用有机溶剂（甲醇或乙腈）将滤膜润湿以后再进行流动相的过滤。

过滤溶剂或者流动相一般用溶剂过滤器+膜过滤。


过滤样品一般用针式过滤器，膜直径为13mm，可以过滤0.5-2ml的样品，如果样品量更大，可以选择直径为25mm的。

孔径的选择
常用滤膜的过滤原理一般为机械截留，即截留比它孔径大或孔径相当的微粒等杂质。因此，滤膜的孔径直接决定了选择性。


常用滤膜的孔径从0.1μm到10μm不等。


溶出、紫外、液相等分析检测常用滤膜的孔径通常为0.22μm、0.45μm和0.8μm。


0.22um：
去除样品，流动相中极细颗粒，适用于要求较高的溶剂和样品的处理，如色谱用离子对试剂、超纯水、质谱分析溶剂的样品等的过滤。


0.45um：
能滤过大多数微生物，适用于常规样品、流动相的过滤，能够满足一般色谱要求。


0.8um：
去除大多数不溶性微粒，适用于紫外等对样品要求相对较低的分析检测，尤其适用于难溶性辅料多、混悬剂和粘合剂用量大、且使用紫外检测的口服固体制剂溶出检测。

针式过滤器使用窍门
针式过滤器是大家做溶出、和液相样品前处理最常用的。一天不知道会有多少次，小编今天就讲一些大家平时很少注意的小窍门。

1.在吸入样品前，先向注射器中吸取约1ml的空气，可以使液体残留量最小；


2.样品吸入注射器中，倒置注射器并将顶端的残留物擦净，将针式过滤器连接到注射器上，轻轻拧紧保证良好密封；


3.将注射器内的样品过滤后注入进样瓶中；


4.取下过滤器，将空气吸入注射器，重新连接过滤头，按下推杆过滤出所有残余样品。最大程度提高样品回收率。


温馨提示：在过滤过程中，最好不使用小于10ml的注射器，以免压力过高引起液体崩漏。

滤膜吸附试验的设计
滤膜使用前需进行考察，明确是否对待测成分有吸附作用。


无论溶出度，还是含量、有关物质，如果滤膜有影响会导致后续产出的结果都是错的。


无论药物结构如何，在试验开始之前考察一下总是对的。


针对不同的分析检测项目，判断滤膜吸附及验证的方法略有不同。

溶出度测定


开始溶出试验前，滤膜吸附试验是必须进行的。


滤膜吸附试验方法如下：
（1）取对照品溶液按规定的方法，对比未过滤直接进样和过滤后的吸光度/峰面积值。
（2）或采用原料加空白辅料的方式配置溶液。分别用高速离心和滤膜过滤的方法处理。对比离心上清液和过滤后溶液的吸光度/峰面积。
（3）分别弃去不同体积的初滤液的考察，参考下表。

以上方法仅供参考，实际项目不同操作方法不同，请根据实际情况进行调整。
、
◆ 判定标准滤膜吸附应在2%以下按下述公式计算回收率或吸附率


回收率Recovery% = A(过滤) / A(过滤前或离心) ×100%


吸附率= 100%－Recovery%
其中：A为UV吸光度或HPLC峰面积值。若回收率在98%~102%之间，即吸附率不超过2%，滤膜吸附作用可忽略不计。

◆ 滤膜吸附过大处理方法如下：
（1）将滤膜在水中煮沸1h以上后再次尝试；


（2）更换滤膜材质或者品牌。或者采用进口滤膜。不同的滤膜、不同的处方工艺生产的产品，其吸附作用不尽相同，应通过实验得出正确结论。若滤膜对原料药不存在吸附现象，但是样品溶出度偏低，可以考虑是否存在辅料吸附API然后被滤除的现象。对于具有明显吸附的品种，应在内控标准中标明所用滤膜的材质、品牌和规格，以及需要弃去初滤液的体积，以确保检测结果准确，可重现。

◆ 什么样的样品容易产生滤膜吸附现象发生吸附的品种，往往是主药均难溶于水，制成制剂时进行过微粉化等处理。这时原料药粒径变小，比表面能变大，静电吸附能力增强，所以与滤膜的吸附作用会比较明显。一些小规格制剂溶出液中主药浓度低，达到饱和所需的初滤液体积明显增加，干扰也会变大。

含量测定、有关物质测定
含量和有关物质使用的溶剂一般都能使样品中主药完全溶出，因此使用样品溶液考察吸附性即可。而对于有关物质检测，如果所用溶剂中有机相比例较高，更需要关注滤膜过滤后是否会产生新的杂质。

药物分析之家