HPLC色谱分离柱主要技术指标及有关问题的探讨

王中泰

HPLC 色谱分离柱主要技术指标及有关问题的探讨

前言

由于 HPLC 具有高速度、高分离效率、高灵敏度等优点，所以其仪器和应用发展很快 [1] 、 [2] 。 HPLC 是一个包括高压泵、色谱柱、检测器的完整系统 [1] ，对 HPLC 分离柱 ( 包括填料 ) 的研发、制造和使用，都有很高的要求、很大的难度。本文根据仪器学理论、分析检测实践的要求，和作者长期研发 HPLC 仪器、使用 HPLC 仪器和色谱柱的经验和教训，重点讨论 HPLC 分离柱及其有关问题，供有关科技工作者参考。

一、色谱柱的主要技术指标

几何尺寸

HPLC 色谱分离柱的核心是填料和几何尺寸，它们都直接影响柱效 ; 例如柱的几何尺寸，直接影响柱效。对使用者来说几何尺寸也非常重要。它包括：柱长、柱子内径、填料颗粒大小 ( 直径 ) 、柱填充密度和均匀性等等。几何尺寸种类繁多，数值各异，因篇幅所限，此不赘述。

主要性能指标 [3]

理论塔板数 ( 柱效 )

理论塔板数 ( 柱效 ) 是衡量色谱柱分离效率高低的指标，使用者希望 HPLC 的色谱柱分离效率高者好，所以，理论塔板数高者为好。

分离度

分离度是 HPLC 色谱柱一个非常重要的技术指标。也是一个容易被生产者、研发者、使用者忽视的指标。分离度通常被定义为：相邻组分色谱峰保留值 ( 时间 ) 之差 △ t 与色谱峰平均峰底 (w1+w2)/2 之比。常用 R 表示。

分离度的图解如下所述：图中 tR1 、 tR2 为保留时间 ;w1 、 w1 为峰底宽。

分离度 R 等于 1 时，两个色谱峰得到基本分离； R 等于 1.5 时，两峰得到完全 ( 基线 ) 分离。在定量分析中，要对色谱峰进行积分时，最少要达到 R 为 1 ，如果达到 R>1.5 ，就可以保证积分中基本没有误差。

分离度的数学表达方程式 [3]

分离度方程式描述了分离度与选择因子、柱效和容量因子之间的关系 ; 它是评价一张色谱图以及如何解决、开发和优化分离方法的依据。所以，分离度是一个非常重要的性能技术指标。

速率理论 [3]

1956 年， Van Deemter 提出，样品峰在色谱柱内的展宽原因如如下所述：

式中：

A 项 涡流扩散 / 粒子间通道 . 取决于颗粒大小；

B 项 分子的轴向扩散 . 反比于流速；

C 项 传质阻力 . 正比于流速和颗粒度的平方。

二、关于 HPLC 分离柱中的核壳柱

核壳柱的出现，是近几十年来， HPLC 的重大突破之一，值得特别重视。目前月旭、纳微、福立等正在研发、生产不同类型的核壳柱，下面对核壳柱的主要优点简单介绍之。

(1) 核壳柱耐压性好、反压低

大多数 HPLC 系统最高限压是 6000 psi(400 bar) 或更低。当填料粒径减小，反压会明显升高，使用亚 2 微米的粒径填充的色谱柱时，常常在超过 6000 psi 时，才可获得最佳流速，这就需要购买更昂贵的 “ 超高压 ” 设备才能获得最佳分离性能。与 3.5 微米粒径填料相比，尽管核壳柱也会产生稍高的反压，但它仍能用于大多数普通的 HPLC 设备。

(2) 柱效极高

同样长度的色谱柱，核壳色谱柱的理论塔板数约是 3.5 ?m 颗粒色谱柱的 2 倍，是 5 ?m 颗粒的色谱柱的 3 倍。

(3) 分离速度快

图中显示了在 HALO Peptide ES-C18 柱上多肽的快速分离， 9 种多肽和 2 种蛋白质在 60 秒内都获得了极好的分离度。

王中泰

(4) 稳定性好 ( 重复性好、漂移小 )

(5) 所需溶剂少，利于环保

主要是柱子短、填料颗粒均匀、核壳型结构等原因使流动相流径短，从而节省了大量溶剂。 下表是以某品牌乙腈 (500 元 /4L) 为例。

(5) 所需溶剂少，利于环保

主要是柱子短、填料颗粒均匀、核壳型结构等原因使流动相流径短，从而节省了大量溶剂。

下表是以某品牌乙腈 (500 元 /4L) 为例。

三、几个有关问题的探讨

要充分认识科学仪器的重要性、要重视仪器学理论

早在 100 多年前，著名科学家门捷列夫 (1834-1907) 就曾说过： “ 没有测量，就没有科学 ” 。科学仪器是测量的最基本、最重要的工具。科学仪器的创新将会引发科学技术的重大突破，带动社会经济的重大变革和进步。

在国计民生中，科学仪器已显示出非常重要的作用，可以说科学仪器已经起到了以下作用：工业生产的 “ 倍增器 ” 、科学研究的 “ 先行官 ” 、军事上的 “ 战斗力 ” 、 国民活动中的 “ 物化法官 ” 等等的关键作用。所以广大科学仪器研发者、生产者、使用者都应该真正认识到科学仪器的重要性。

然而，目前，我国的广大科技工作者中，还有很多人，虽说每天都在使用科学仪器，但是对仪器的认识还是有不少差距 ; 例如：自己使用的 HPLC 仪器有哪些最重要的技术指标、哪些技术指标对分析误差会产生很大的影响。如何评价选择分析仪器、如何选择 HPLC 仪器的分析测试条件、如何保证分析误差最小、如何得到最佳分析检测数据等等，很多 HPLC 仪器使用者还是没有搞清楚或还没有真正完全搞清楚这些问题。

其实，这些问题，从仪器学理论中，都能全面的、清楚的找到答案。仪器学理论是一门涉及到光学、机械学、电子学、计算机、使用等等各个方面的学科。它是一把金钥匙，可以使你一通百通、可以使你研发生产出可靠性好的优质仪器，可以保证你把仪器用到最佳状态，保证得到最佳分析检测数据。所以，这些问题，必须引起广大从事科学仪器研发、应用的科技工作者们重视。

应该充分认识 HPLC 是由泵、柱、检测器组成一个完整系统的特点 [5]

从仪器学理论和分析检测工作的实际要求着眼，研发生产 HPLC 分离柱及其填料的厂商，应该从整体出发，同时研发、生产 HPLC 的恒流泵和有关检测器，以提高我国 HPLC 仪器整体 ( 系统 ) 的水平。

目前很多研发、使用 HPLC 的科技工作者，没有搞清楚或没有完全搞清楚 HPLC 中的泵、柱、检测器三者的关系。目前，国内外很多生产厂商只是生产泵、检测器，色谱柱子大多都是外购件。我们说 HPLC 是一个系统，是指泵、柱、检测器三者组成的一个完整的系统。

如果只生产泵、检测器，就不能说是生产完整的 HPLC 仪器，只是生产了 HPLC 的两种部件，再买一根色谱柱组装成一台完整仪器后出售。所以，这样生产的 HPLC 系统，到了用户那里，总是不好用或者不大好用。而广大使用者，由于没有将 HPLC 的泵、柱、检测器三者互相影响的关系搞清楚，所以很多使用者不能将 HPLC 用到最佳水平、不能得到误差最小的最佳分析检测数据。从仪器学理论和本人长期的研发和使用 HPLC 的实践经验来看，作者认为 HPLC 的研发、使用者，应该特别重视处理好以下几个问题：

(1) HPLC 是一个系统，必须将泵、柱、检测器三者 ( 三个部件 ) 结合起来才能叫 HPLC 仪器。只有三者分别都合格，三者联机后也合格，才能说这台 HPLC 合格。三个部件有一个不合格，联机后的整机系统肯定不合格。即使三个部件都合格，联机后，也不一定合格。只有泵、柱、测器三者雷竞技百科 都合格，并且联机后整机检测结果也合格，才能说明这台 HPLC 仪器是合格的。

(2) 本人长期使用过 HPLC ，也研发 HPLC 仪器，实践使本人深深认识到：必须将三个部件联接起来检验测试，并能达到雷竞技百科 指标要求，才能说这台 HPLC 达到了雷竞技百科 要求。否则，只能说是部件合格，而整机系统不一定能合格。

为什么 ? 因为：

① 泵会因为柱子问题产生压力不稳、流量不稳定，会影响 HPLC 系统的雷竞技百科 ;

② 柱对泵影响很大：柱堵塞、柱沾污、柱接头漏液等，都会影响泵的压力波动、使流速不稳定，会影响系统不稳，使 RSD 变坏、峰拖尾、灵敏度降低 ;

③ 柱对检测器影响很大：柱效降低 ( 柱塔板数降低 ) 、柱堵塞、柱的新旧程度、接头、管道漏液等，都会影响检测器的检测限、分辨率、噪声、和灵敏度。

但是，色谱柱是易损件，用户会经常在色谱柱长时间使用后换新柱，此时 HPLC 系统的泵和检测器基本进入 “ 电子元件失效理论 ” 的盆底，比较稳定了。所以，不会因为换新柱而产生仪器不能使用的问题。特别应该指出的是：用户换新柱后，一般不检测系统的综合指标。如果检测指标，可能就不能达到原出厂指标 ( 因为泵和检测器经过较长期使用后，雷竞技百科 会有所下降，旧泵、新柱、旧检测器三者不能达到最佳配备 ) ，但是不会影响使用。

用户换新柱不会影响使用的问题，可以从计量认证标准规范 (JJG) 得到佐证。 JJG 检验的仪器，很多是在用仪器，它明确规定被检仪器的指标可以比新出厂的仪器指标低，甚至有些指标因为达不到要求而免检。但我们的制造企业，在仪器出厂前，必须检测系统的指标，只有系统指标达到设计要求时，才算合格，才能出厂。至于用户换新检测器、换新泵、同样都是允许的。

④ 检测器更是直接影响分析测试数据可靠性的关键部件之一，研发者、生产者、使用者都必须高度重视之，才能得到优质的 HPLC 系统。

核壳柱是新型色谱柱，是 HPLC 技术的最重大的突破。

如前所述，核壳柱有很多优点或特点，它是保证高分离效率、保证 HPLC 高灵敏度、保证高速度的关键所在。并且，它有很多潜力可挖。所以，我们应该花大力气去研究核壳柱及新型的色谱柱。

主要参考文献

[1] 李昌厚，高效液相色谱仪器及其应用，北京：科学出版社， 2014.

[2] 李昌厚，高效液相色谱仪器及其最新进展和有关问题， 2019 年，仪器信息网 . ， 2019-11-07.

[3] 闫超，液相色谱及其应用的最新进展， “ 我国科学器自主创新发展 ” 雷竞技官网怎么样 ， 2012 年 8 月 23 日，上海。

[4] 李昌厚，仪器学理论与实践，北京：科学出版社， 2008.

[5] 李昌厚，用好 HPLC 的九大关键问题，仪器信息网， 2020/2/26.

来源：中国科学院上海生物工程研究中心