食品微生物菌落总数、大肠菌群等标准的理解要点

王中泰

食品微生物菌落总数、大肠菌群等标准的理解要点

GB 4789.2-2022食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定

1、稀释度的选择

液体样品可直接取原液进行检验；固体或者半固体则必须依据检验经验，选取 1-3 个适宜稀释度进行检验（一般样品选取 1:10,1:100,1:1000 三个稀释度进行检验。若遇到不常做的样品，可适当延长稀释度至 1 ： 10000 甚至更大）。

2、空白实验

分别吸取 1mL 灭菌生理盐水到平皿中做空白对照，若空白有菌落生长则该实验无效。

3、培养基的倾注

根据对样品污染情况的估计，若样品有表面蔓延生长的可能性，则待第一次倾注的琼脂凝固后，可在表面再覆盖一层琼脂以避免菌落蔓延而难以计数。

4、菌落总数的计算

本标准的难点在于菌落计数及计算。

1 ）菌落计数时，从低稀释度的平板开始计数。若所有平板上的菌落数均小于 30CFU ，则需计数所有平板上的菌落数，但仅采用最接近 30CFU 的两个平板的菌落数来计算最终菌落数。

以固体样品为例，菌落数选取、计算过程及结果修约如下：[size=18.6667px]

2 ）当第一稀释梯度一个板上菌落数高于 30 ，另一个低于 30 ，则依据标准应当以介于 30-300 之间的菌落数作为该稀释梯度的菌落数。

以固体样品为例，菌落数选取、计算过程及结果修约如下：
[size=18.6667px]

3 ）若所有平板上的菌落数均大于 30CFU ，则只计数 30-300CFU 之间的平板上的菌落数，并采用这些数据，依据标准中给出的公式，进行最终菌落总数的计算，此时将大于 300CFU 的记为“多不可计”，以 TNTC 表示。

以固体样品为例，菌落数选取、计算过程及结果修约如下：
[size=18.6667px]

4 ）若所有稀释度的平均菌落数都大于 300 ，则不能所有都记为 TNTC ，必须将最高稀释度的两个平板上的菌落数逐一的计数，再计算平均数，该平均数为该梯度的菌落总数，其余平板上的菌落数可记为 TNTC 。

以固体样品为例，菌落数选取、计算过程及结果修约如下：
[size=18.6667px]

5 ）若所有平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数。

注意：

最低稀释度的选择对结果存在较大的影响。如：某样品经多次检验后发现菌落总数较高，检验人员在梯度稀释后取 1 ： 1000 ， 1:10000 ， 1:100000 三个梯度的稀释液倾注平板，最终所有平板上均无菌落生长，则计算结果为＜ 1000CFU/mL 。若选取 1 ： 10 ， 1:100 ， 1:1000 三个梯度的稀释液倾注平板，均无菌生长，则最终结果为＜ 10CFU/mL 。

6 ）最低稀释度两个平板只有一个平板上长了 1 个菌落，若为固体样品且本次检验的最低稀释倍数为 1:10 ，此时计算过称为 (1+0)/2 × 10 ＝ 5 ，由于默认固体样品的最小检出量为 10CFU ，固本次检验的菌落总数结果为 10CFU 。

注意：

对于该情况，一直存在争议，不同的检验人员可能做法不一，有人保留为 5CFU ，有人保留为 10CFU ，并无固定做法，建议实验室保持一贯做法，不要随意更改。

GB 4789.3-2016 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数

第一法大肠菌群MPN法

1、取样原则

本标准中对应的检样量分别为 0.1g （ mL ）、 0.01g （ mL ）、 0.001g （ mL ），根据样品限量值，查阅附录部分 MPN 表。

（ 1 ）无论固体或液体，当限量值为“＜ 3.0 ”或其它任意能在标准“表 1 ”中查到的数值，则分别取 1mL 1 ： 10 的样品匀液接种到 3 管单料 LST 肉汤管、分别取 1mL 1 ： 100 的样品匀液接种到 3 管单料 LST 肉汤管、分别取 1mL 1 ： 1000 的样品匀液接种到 3 管单料 LST 肉汤管；

（ 2 ）无论固体或液体样品的限量值为“＜ 0.3 ”或其它任意为 MPN 表中查到的数值缩小 10 倍的数值，则分别取 10mL 样品 1:10 稀释液接种到 3 管双料 LST 肉汤管、分别取 1mL 1 ： 10 的样品匀液接种到 3 管单料 LST 肉汤管、分别取 1mL 1 ： 100 的样品匀液接种到 3 管单料 LST 肉汤管（如蜂蜜的限量值为 0.3MPN/g ，即采取此做法）。

2 、凡产酸或产气的LST管，都取1环接种GBLB肉汤管，凡BGLG产气者记为阳性。

第二法平板计数法

常见问题汇总

1、VRBA培养相关问题

1 ）所用器皿是否需要灭菌？

不需要。配制培养基所用到的锥形瓶、玻璃棒、勺子等均不需要灭菌。但必须清洗干净，表面无污渍、无残留。煮沸完成后，取下锥形瓶，用一般常用的软纸覆盖瓶口，并橡皮筋缠绕，待冷却至适宜温度后，即可倾注培养基。在倾注培养基时，须点燃酒精灯，稍微灼烧锥形瓶口。

2 ）如何保持“煮沸 2min ”？

可以用电磁炉或者电热板进行加热煮沸，在该培养基即将煮沸时调低温度。实际操作时，不需要严格按照此要求进行，加热煮沸数秒即可。因为本培养基很难保持煮沸 2min ，一旦煮沸，则培养基很快上涌、翻腾，若不调低问题或及时采取其它措施，则培养基很有可能在数秒内喷涌出来，严重者可喷涌 2 米以上、电磁炉周围 1-2 米范围内都是培养基飞溅的范围。

3 ）若培养基未用完，是否可以冷藏起来下次用？

不可以。 4789.28 中已规定，固体培养基最多允许熔融一次，并且特指经过高压霉菌冷却后的培养基还可以熔融一次后使用。且 VRBA 培养基冷却后，再次熔融后非常容易喷涌，若温度控制不当，底部培养基熔融后很快就会发生喷涌，即培养基未完全熔融就会发生喷涌现象。

4 ）倾注完成后是否需要“覆盖一层 "? 如何覆盖？

一般情况下不需要覆盖。在实际操作过程中，若检验员初次接触该样品类别，则因为不确定是否会发生菌落蔓延，所以有必要在倾注培养基的时候再覆盖一层，但如此反复多次测试后，若样品中不存在菌落蔓延情况，则以后的检验中都不需要进行覆盖。若重复多次测试后都有蔓延情况，则以后的检验中都需要覆盖，应该在原培养基已凝固或半凝固时再倾注一层培养基。

2 、如何确定培养基上长得是不是大肠菌群？

建议新手们认真按照标准进行证实实验，此证实实验操作简单，每一次 VRBA 上有菌落生长都进行证实实验，如此往复 3-4 次，对于哪种形态才是大肠菌群均可了然于心。

3 、两个梯度都长了菌，如何选取？

选取 15-150CFU 之间的平板，挑选可疑菌落进行证实实验。

举例如下：

若两个连续梯度的 4 个平板上都要挑取菌落进行证实实验，实际操作时，可灵活操作，如 1:10 的两个平板上的菌落数分别为 120 、 123 ， 1:100 的两个平板的菌落数分别为 16,18 ，严格来讲必须至少在每个平板上分别挑取 10 个可疑菌落和 10 个典型菌落进行证实实验，如此需要 40 根 GBLB 肉汤管。

建议使用镍合金接种环，因为 VRBA 上生长的菌落大部分在底层、且菌落一般比较大，被培养基覆盖，传统的接种环较细，用以刮去上层培养基比较方便，挑取菌落也比较方便。

4 、如何进行证实实验，菌落选取数量？

建议新手们 VRBA 上的所有不同形态的菌落都进行证实实验。每种不同形态都挑取 5-10 个进行证实实验（ BGLB 管足够，建议多挑选几个进行实验）。
注意： A. 每种可疑菌落挑取 5 个，每个菌落放入 1 根 GBLB 管中； B. “产气者，记为大肠菌群阳性管‘’，就要求在实验前必须认真筛选 BGLB 管，凡产气的 GBLB 管应弃去不用。

5 、结果如何计算？

首先，在 VRBA 培养 24h 后进行计数，分别计数可疑大肠菌群和典型大肠菌群的数量。假如在 1:10 的平板上的可疑大肠菌群有 10 个，典型大肠菌群有 6 个；然后进行证实实验，假如 10 个可疑大肠菌群中有 3 个证实为阳性， 6 个典型大肠菌群中有 5 个证实为阳性，则计算方法如下：

最终大肠菌群数 = 经证实的大肠菌群数 = 可疑大肠菌群经证实的数量 + 典型大肠菌群。

经证实的数量 =10 ×（ 3 ／ 10 ）× 10+6 ×（ 5 ／ 6 ）× 10 ＝ 80 。

6 、若平板上有很多菌落，最终证实全部为阴性，结果如何计算？

选取适宜菌落数的平板挑取菌落进行证实试验，若证实全部为阴性，则需要再挑取更低稀释度的平板上的菌落，建议可疑和典型菌落分别挑取 10 个进行验证试验，若第二次证实实验均呈阴性，以＜ 1 乘以最低稀释度进行计算。

希望以上内容对您有所帮助！

本文来源于食品实验室服务

wswjcy_04

不明白为什么菌落数和平均数为什么能求平均值？ 3）那里应该是:[（245+246+31）/（2×1+1×0.1）]／0.01＝24857

yujiansp

谢谢楼主分享

yiran21qwe

谢谢楼主分享

王中泰

yiran21qwe 发表于 2023-12-9 08:00
谢谢楼主分享

谢谢您的关注！

王美丽666

非常实用，收藏，谢谢老师

鱼儿小可爱

感谢分享！