食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》GB 4789.35-2023主要变化

王中泰

食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》 GB4789.35-2023 主要变化

2023 年 9 月 25 日下午，食品安全标准与监测评估司官网发布了经国家卫生健康委和市场监管总局联合网批准的《食品安全国家标准?食品微生物学检验乳酸菌检验》（ GB 4789.35-2023 ?）等 85 项食品安全国家标准和 3 项修改单的公告。下新标准将代替 GB4789.35-2016 《食品安全国家标准?食品微生物学检验乳酸菌检验》，将于 2024 年 03 月 06 日起正式实施。

本文主要通过对比 2023 版与 2016 版标准，使读者更好地了解乳酸菌检验修订的变更发展，以便更好地掌握乳酸菌检验的发展方向。

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本标准与 GB4789.35 2016 相比 主要变化如下：
1 、增加了实时荧光 PCR 方法为选做方法；

2 、修改了乳酸菌的定义、样品制备、培养时间 ;

3 、修改了嗜热链球菌和乳杆菌计数方法的描述 ;

4 、修改了部分培养基成分、储备液浓度和制备方法。

1 、范围

本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌 (lactic acid bacteria) 的检验方法。

本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。

无变化

2014 年 8 月 6 日国家卫生和计划生育委员会公布的《可用于食品的菌种名单》中，还有乳球菌属和片球菌属。现在不少乳品生产企业在发酵乳产品中添加了这些球菌。因此，进行发酵乳制品的乳酸菌检验时，无法避免这两类球菌造成的干扰。

2 、术语和定义

2.1 乳酸菌 lactic acid bacteria

一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称 , 不能液化明胶、不产生咧喋、革兰氏阳性、无运动、无芽孢、触酶阴性、硝酸还原酶阴性及细胞色素氧化酶阴性反应的细菌。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属 (Lactobacillus), 双歧杆菌属 (Bif idobacterium) 和嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus) 。

变化

修改了乳酸菌的定义，增加其生化现象的描述（但是生化实验没有做）。

3 、设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外 , 其他设备和材料如下：

3.1 恒温培养箱 :36 ℃士 1 ℃。

3.2 厌氧培养装置 : 厌氧培养箱﹑厌氧罐、厌氧袋或能提供同等厌氧效果的装置。

3.3 冰箱 :2 ℃ ~8 ℃。（范围扩大）

3.4 均质器及无菌均质袋 , 均质杯或灭菌乳钵。

3.5 涡旋混匀仪。

3.6 电子天平 : 感量 0.001 g 。（精度升高）

3.7 实时定量 PCR 仪。

3.8 恒温水浴锅或金属浴。

3.9 离心机 : 离心力≥ >10 000 × g 。

3.10 无菌试管 :18 mm × 180 mm,15 mm × 100 mm 。
3.11 无菌吸管 : l mL( 具 0.0l mL 刻度 ) 、 10 mL( 具 0.1 mI 刻度 ) 。

3.12 微量移液器和灭菌吸头 :2 pL 、 10 u.L.100 pL200 p.L 1 000 uL 。

3.13 无菌锥形瓶 :500 mL,250 mL 。

3.14 无菌平皿 : 直径 90 mm 。

3.15 PCR 管。

变化

1. 增加设备：厌氧装置、涡旋混匀仪、实时定量 PCR 仪、恒温水浴锅或金属浴、离心机、微量移液器和灭菌吸头、无菌平皿、 PCR 管等；

2. 电子天平精度由 0.01g 改为 0.001g ；主要是为了保证对于那些活菌菌种制品的称量准确性；

3. 冰箱温度范围由 2 ℃ ~5 ℃改为 2 ℃ ~8 ℃。

4 、培养基和试剂

4.1 稀释液 : 见附录 A 中 A.1 。（新增）
4.2 MRS(Man Rogosa Sharpe) 琼脂培养基 : 见附录 A 中 A.2 。

4.3 莫匹罗星锂盐 (Li Mupirocin) 和半胱氨酸盐酸盐 (Cysteine Hlydrochloride) 改良 MRS 琼脂培养基 : 见附录 A 中 A.3 。

4.4 MC 培养落 ( Modified Chalmers 培养基 ): 见附录 A 中 A.4 。

4.5 0.5% 蔗糖发酵管 : 见附录 A 中 A.5 。

4.6 0.5% 纤维二糖发酵管 : 见附录 A 中 A.5 。

4.7 0.5% 麦芽糖发酵管 : 见附录 A 中 A.5 。

4.8 0.5% 甘露醇发酵管 : 见附录 A 中 A.5 。

4.9 0.5% 水杨苷发酵管 : 见附录 A 中 A.5 。

4.10 0.5% 山梨醇发酵管 : 见附录 A 中 A.5 。

4.11 0.5% 乳糖发酵管 : 见附录 A 中 A.5 。

4.12 七叶苷发酵管 : 见附录 A 中 A.6 。

4.13 革兰氏染色液 : 见附录 A 中 A.7 。

4.14 生理盐水 : 见附录 A 中 A.8 。

4.15 DNA 提取液 : 见附录 A 中 A.9 。（新增）

4.16 10XPCR 缓冲液 : 见附录 A 中 A.10 。（新增）

4.17 莫匹罗星锂盐 (C26HIx;O,- Li): 化学纯。

4.18 半胱氨酸盐酸盐 (C: I1;ClNO,S): 纯度 99 % 。

4.19 dNTPs 。（新增）

4.20 Taq DNA 聚合酶 :5 U/ pL 。（新增）

4.21 七种乳酸菌引物探针。（新增）

4.22 灭菌去离子水。（新增）

变化

增加培养基：稀释液 ;

针对现有稀释液对某些乳酸菌计数结果偏低等情况，修改了样品前处理时所用稀释液成分和温度。经验证，稀释液“生理盐水 +1.5% 胰蛋白胨（ 37 ℃预热）”在乳酸菌检验中，计数结果优于其它稀释液；

增加实时荧光 PCR 检测用试剂 NA 提取液、 10XPCR 缓冲液、 dNTPs 、 Taq DNA 聚合酶、七种乳酸菌引物探针、灭菌去离子水等；

5 、检验程序

王中泰

变化

1. 检验程序主要修改点为增加乳杆菌计数。

6 操作步骤

6.1 样品制备

6.1.1 样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。

6.1.2 稀释液在试验前应在 36 ℃士 1 ℃条件下充分预热 15 min~30 min 。

6.1.3 冷冻样品可先使其在 2 ℃ ~5 ℃条件下解冻，时间不超过 18h, 也可在温度不超过 45 ℃的条件解冻 , 时间不超过 15min 。

6.1.4 固体和半固体样品 : 以无菌操作称取 25g 样品 , 置于装有 225 mL 稀释液的无菌均质杯内 , 于 8 000 × g ~10 000 × g 均质 l min~2 min, 制成 1 ∶ 10 样品匀液 ; 或置于 225 mL 稀释液的无菌均质袋中 , 用拍击式均质器拍打 l min~-2 min 制成 l ∶ 10 的样品匀液。

6.1.5 液体样品 : 液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品 25 mL 放入装有 225 mL 稀释液的无菌锥形瓶 ( 瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠 ) 或均质袋中 , 充分振摇或拍击式均质器拍打 l min~2 min, 制成 1 ∶ 10 的样品匀液。

6.1.6 经特殊技术 ( 如包埋技术 ) 处理的含乳酸菌食品样品应在相应技术 / 工艺要求下进行有效前处理。

变化

1. 增加稀释液预热的操作；

2. 增加特除技术处理的乳酸菌食品样品的前处理要求；

3. 液体样品处理增加拍打均质器的操作。

6.2 稀释及培养

6.2.1 用 l mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1 ∶ 10 样品匀液 l mL, 沿管壁缓慢注于装有 9 mL 稀释液的无菌试管巾 ( 注意吸管或微量移液器吸头尖端不要触及稀释液 ), 振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀 , 制成 1 ∶ 100 的样品匀液。

6.2.2 另取 l mL 无菌吸管或微量移液器吸头 , 按上述操作顺序 , 做 10 倍递增样品匀液 , 每递增稀释一次 , 即换用 1 次 l mL 灭菌吸管或吸头。

6.2.3 经特殊技术 ( 如包埋技术 ) 处理的含乳酸菌食品应按照相应技术 / 工艺要求进行稀释。（新增）

6.3 乳酸菌计数

6.3.1 乳酸菌总数

乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明见表 1 。

6.3.2 双歧杆菌计数

根据对待检样品双歧杆菌含量的估计 , 选择 2 个 ~3 个连续的适宜稀释度 , 每个稀释度吸取 1mL 样品匀液于灭菌平皿内 , 每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后 , 将冷却至 48 ℃ ~50 ℃的莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良 MRS 琼脂培养基倾注入平皿 15 mL~20 mL, 转动平皿使混合均匀。培养基凝固后倒置于 36 ℃士 1 ℃厌氧培养 , 根据双歧杆菌生长特性，一般选择培养 48 h, 若菌落无生长或生长较小可选择培养至 72 h, 培养后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板倾注要求在 15 min 内完成。

6.3.3 嗜热链球菌计数

根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计 , 选择 2 个 ~3 个连续的适宜稀释度 , 每个稀释度吸取 1mL 样品匀液于灭菌平皿内 , 每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后 , 将冷却至 48 ℃ ~50 ℃的 MC 琼脂培养基及时倾注入平皿 15 mL~20 mL, 转动平皿使混合均匀。培养基凝固后倒置于 36 ℃土 1 ℃有氧培养 , 根据嗜热链球菌生长特性 , 一般选择培养 48 h, 若菌落无生长或生长较小可选择培养至 72 h 。嗜热链球菌在 MC 琼脂培养基平板上的菌落特征为 : 菌落中等偏小 , 边缘整齐光滑的红色菌落，直径 2 mm 士 l mm, 菌落背面为粉红色。从样品稀释到平板倾注要求在 15 min 内完成。

6.3.4 乳杆菌计数

根据待检样品活菌总数的估计 , 选择 2 个 ~3 个连续的适宜稀释度 , 每个稀释度吸取 1 mL 样品匀液于灭菌平皿内 , 每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后 , 将冷却至 48 ℃ ~50 ℃的 MRS 琼脂培养基倾注入平皿 15 mL~20 mL, 转动平皿使混合均匀。培养基凝固后倒置于 36 ℃士 1 ℃厌氧培养 , 根据乳杆菌生长特性，一般选择培养 48 h, 若菌落无生长或生长较小可选择培养至 72 h 。从样品稀释到平板倾注要求在 15 min 内完成。

变化

1. 修改了文字描述；

2. 培养基温度和倾注的培养基的量均改为了一定的范围；

3. 培养时间根据培养生长特性可以培养 48h 至 72 h 。

6.4 菌落计数

见 GB 4789.2 菌落计数部分。

6.5 结果的表述

见 GB 4789.2 计算方法部分。

6.6 菌落数的报告

见 GB 4789.2 菌落总数的报告部分。

7. 结果与报告

根据菌落计数结果出具报告 , 报告单位以 CFU/g(mL) 表示。

8. 乳酸菌的鉴定 ( 可选做 )

8.1 第一法 生化鉴定

8.1. 纯培养

挑取 3 个或以上单菌落 , 嗜热链球菌接种于 MC 琼脂平板 , 置 36 ℃士 1 ℃有氧培养 48 h, 乳杆菌属接种于 MRS 琼脂平板 , 置 36 ℃士 1 ℃厌氧培养 48 h 。

8.1.2 双歧杆菌的鉴定

按 GB 4789.34 的规定操作。

8.1.3 涂片镜检 :

嗜热链球菌菌体镜下呈球形或球杆状 , 直径为 0.5 um~2.0 um, 成对或成链排列 , 无芽孢 , 革兰氏染色阳性。乳杆菌属镜下菌体形态多样 , 呈长杆状 . 弯曲杆状或短杆状 , 无芽孢 , 革兰氏染色阳性。

变化

1. 修改了文字描述，强调形态是在镜下的；

8.1.4 乳酸菌种主要生化反应

乳酸菌种主要生化反应见表 2 和表 3 。

王中泰

8.2 、第二法实时荧光 PCR 法鉴定

8.2.1 纯培养

同 8.1.1 。

8.2.2DNA 模板制备

使用接种环刮取 MC 琼脂平板或 MRS 琼脂平板上的菌落 2 个 ~10 个 , 悬浮于 200uL 灭菌生理盐水中 , 充分混匀 ,10 000 × g ~12 000 × g 离心 3 min, 弃去上清。加入 50uLDNA 提取液涡旋混匀 , 置于 100 ℃水浴或者金属浴中 10 min 后迅速冷却 ,10 000 × g~12 000 × g 离心 3 min 。吸取上清液至新的 PCR 反应管内 , 作为 DNA 模板使用。提取后的 DNA 模板应置于 4 ℃供当天使用 , 否则应于 -20 ℃以下保存 , 并于 1 周内使用。

注 : 根据实验室实际情况﹐也可用商品化试剂盒制备 DNA 模板。

8.2.3 PCR 反应体系

总反应体系体积为 25 uL:10 × PCR 缓冲液 2.5 uL 、上下游引物 (10 umol/L) 各 l uL 、探针 (10 umol/L)0.5 pL,dNTPs(2.5 umol /L)3uL 、 Taq DNA 聚合酶 (5 U/uL)0.5uL, 模板 DNA 1uL 、灭菌去离子水补足至 25uL 。每个反应均应设置至少 2 个平行。

注 : 反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总休积进行适当调整。亦可选用含有 PCR 级冲液、 MgCl2 ,dNTP 和 Taq 酶等成分基于 Taqman 探针的实时荧光 PCR 预混液。

8.2.4 PCR 反应条件

50 ℃ 5 min,95 ℃预变性 3 min,94 ℃变性 5s,60 ℃退火延伸 40 s( 同时收集 FAM 荧光 ), 进行 40 个循环。

注 CR 反应参数可根据基因扩增仪型号实时荧光 PCR 反应体系进行适当调整。

鉴定用引物和探针序列见表 4 。

8.2.5 对照设置

检测过程 ( 包括 DNA 提取 ) 中 , 每个反应均应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。其中阳性对照模板为扩增片段的阳性克隆分子 DNA 或阳性菌株 DNA, 阴性对照模板为非乳酸菌菌株 DNA, 空白对照模板为无菌水。

8.2.6 结果判读

8.2.6.1 对照的结果判读

阳性对照出现典型扩增曲线 ,Ct ≤ 30; 阴性对照无典型扩增曲线或 Ct ≥ 40; 空白对照无典型扩增曲线或 Ct ≥ 40 。否则 , 结果视为无效。

8.2.6.2 样品的结果判读

当样品检测 Ct ≥ 40 时 , 判定样品结果为某种乳酸菌阴性 ; 当检测 Ct ≤ 35, 可判定该样品结果为某种乳酸菌阳性 ; 当检测 35 时 , 重复试验 , 若重复试验结果检测 ct ≥ 40, 则判定为某种乳酸菌阴性，否则 , 判定为某种乳酸菌阳性。

王中泰

附录

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