微生物实验室如何进行无菌间灭菌呢？

王中泰

微生物实验室如何进行无菌间灭菌呢？

最近经常看到有实验员咨询：我的无菌室空白验证长菌落了，是不是无菌室灭菌不彻底啊！我们的无菌室应该用什么方式灭菌？等等。无菌室作为我们微生物检测的空间，一旦出现这种情况大家都会感到担忧，会有疑问：在这样的环境里检测，结果能准确吗？

首先我们应该了解我们的无菌室应该处于什么状态，有什么要求。一般情况下，我们的无菌室达到空间洁净度 10000 级就可以了，但操作区域例如超净工作台、生物安全柜里需要达到洁净度 100 级，也就是我们常说的“整体万级，局部百级”。万级洁净度对空间落菌的要求是：静态检测，自然沉降菌≤ 3CFU/ 皿，百级洁净度对空间落菌的要求是：静态检测，自然沉降菌≤ 1CFU/ 皿。也就是说平时我们做的空间验证，只要不超过这个标准，就是符合要求的，因此也不必太过担忧。

那么，怎样能够保证我们的无菌室符合要求？当我们的无菌室出现异常应该如何处理？

我们得先从无菌室的灭菌方式开始讲。一般无菌室的灭菌方式分为：紫外线照射、臭氧灭菌、化学熏蒸这几种。这几种灭菌方式各自有各自的特点，大家可以根据自己的实际情况来选择合适的灭菌方式，遇到异常难以解决时，也可以考虑增加一种灭菌方式来解决。

紫外线照射：紫外线灭菌是利用适当波长的紫外线破坏微生物机体细胞中的 DNA 或 RNA 结构，造成生长性细胞死亡来达到灭菌效果，属于一种物理方式的灭菌，也是我们微生物检测无菌室最常用的灭菌方式。该方法操作简单，使用方便，也比较经济，可以杀灭各种微生物，包括细菌、病毒、真菌、立克次体以及支原体等，因此在实验室里，是最常见的灭菌方式。

但紫外线灭菌也有一定的缺点，紫外线只能对直接照射到的微生物起到杀灭作用，因此只能对空间中照射到的地方起作用，一些照射不到的死角或者物品的内部是无法达到效果的，因此使用紫外线灭菌的无菌室，也会辅助以一些化学试剂，例如洁尔灭、酒精等消毒剂对死角进行清理。使用紫外线灭菌，应当定期检测紫外线的强度，若是无法达到要求的强度，就应该考虑更换紫外灯。

根据 2002 年国家卫生部发布的《消毒技术规范》，紫外灯的要求是紫外线强度不得低于 70 μ W/cm2 （紫外灯 1m 处），而空间内的紫外灯的布局也是有要求的，要求平均每 m3 不少于 1.5W 。也就是说，假如你无菌室是 5m2 ，实验室高度是 3 米，那么你的空间体积就是 15m3 ，你空间中使用的紫外灯的功率就不得低于 22.5w 。按照这个方式就可以算一下你的无菌室需要多少紫外灯了。当紫外线的强度达不到要求时，就需要更换紫外灯了。

臭氧灭菌：臭氧是一种强氧化剂，灭菌过程属生物化学氧化反应。

O3 灭菌原理一般有以下三种：

1. 臭氧通过氧化分解细菌内部葡萄糖所需的酶，使细菌灭活死亡。

2. 直接与细菌、病毒作用，破坏它们的细胞器和 DNA 、 RNA ，使细菌的新陈代谢受到破坏，导致细菌死亡。

3. 透过细胞膜组织，侵入细胞内，作用于膜内的脂蛋白和内部的脂多糖，改变细胞的通透性，导致细胞溶解死亡。

使用臭氧灭菌，杀菌彻底，无残留，杀菌广谱，可杀灭细菌繁殖体和芽孢、病毒、真菌等，并可破坏肉毒杆菌毒素。另外， O3 对霉菌也有极强的杀灭作用。 O3 为气体，能迅速弥漫到整个灭菌空间，灭菌无死角。所以，臭氧灭菌也是目前被广泛使用的灭菌方式。用臭氧消毒空气，必须是在封闭空间，且室内无人条件下进行，消毒后至少过 30min 才能进入。另外臭氧的密度比空气大，在空气中会迅速下降到空间的底层，因此臭氧发生器也应当安装在无菌室的顶部。一般灭菌时间选择 30min 即可，要求空间中臭氧浓度不低于 20mg/m3 。

化学熏蒸：

化学熏蒸是一种十分传统的空间灭菌方式，一般是采用易挥发气化的化学物质的蒸汽对空间微生物进行杀灭的目的，一般常用甲醛、戊二醛、过氧化氢、过氧乙酸等。

这里以常用的甲醛熏蒸为例。一般甲醛熏蒸又称甲醛高锰酸钾熏蒸，将 40% 的甲醛溶液加入到高锰酸钾溶液中，二者发生反应，放出大量的热使甲醛蒸发到空间中，从而对无菌室进行灭菌。一般甲醛熏蒸的灭菌效果比较理想，对霉菌等较难清除的污染菌也有较好的杀灭效果，因此在无菌室被霉菌污染时，通常都是使用甲醛进行熏蒸来彻底消灭污染源。

但是甲醛熏蒸的缺点也是很明显的，因为甲醛是一种强致癌性的化学品，对人体的伤害较大，在使用过程中需要特别注意，并且残留量也要进行严格的控制。每次熏蒸后，至少需要通风 24h 才可以使用。

目前对熏蒸后甲醛的残留量并没有明确要求，还是要通过经验来判断，目前国家对居民住房要求甲醛含量不大于 0.1mg/m3 ，所以我们也可使用甲醛含量测定仪来对熏蒸后的空间进行检测。目前甲醛熏蒸灭菌的方法食品检测无菌室的灭菌中已经较少使用，主要也是因为操作比较繁琐，灭菌时间较长，进行一次甲醛熏蒸之后，会有几天无法使用无菌室进行检测，所以只有在其他灭菌方法无法达到理想的灭菌效果时，才会考虑进行甲醛熏蒸。

而其实这种灭菌方式目前在很多药企的无菌室灭菌，还是会经常用到的，另外，有些生产区域如果长期被霉菌污染，也会考虑用甲醛熏蒸的方法来解决。

了解了这几种常用的无菌室灭菌方式，在我们日常的工作中也可以根据自己实验室情况进行选择，尤其是长期使用一种灭菌方式若是灭菌效果达不到理想的效果时，可以根据实际情况更换灭菌方式，或者引进一种新的灭菌方式两者结合，以期达到预想的效果。

一念红尘

老师的内容很有深度，我们一般性室内是紫外杀菌，霉菌培养箱我一般用紫外，孢子剂，酒精杀菌，但只能抑制，下次没有培养的时候，打开霉菌培养箱，用臭氧杀菌试试。看看能不能彻底杀死霉菌。

sunnyhze

我们用臭氧发生器灭菌半小时以上，没有失手过~

zengguifang

无菌室做微生物试验结果空白总是长几个菌、试验之前无菌室物理杀菌和消毒片杀菌了啊、求各位大神帮忙指点迷津多谢

zengguifang

微生物检测空白这几次总是长几个菌、哎头疼啊请求帮忙

王中泰

zengguifang 发表于 2023-9-28 16:06
微生物检测空白这几次总是长几个菌、哎头疼啊请求帮忙

空白长菌是被感染了，检查你操作及无菌室环境卫生，好好消毒。