不同浓度乙醇溶液杀菌效果观察及其杀菌机制

王中泰 · 发表于 2023-9-6 21:56

本帖最后由 xilinxu 于 2023-9-7 05:40 编辑

不同浓度乙醇溶液杀菌效果观察及其杀菌机制

乙醇作为消毒剂广泛用于皮肤黏膜以及器具、设备表面消毒，还广泛用于各种皮肤黏膜消毒剂的复配成分。乙醇作为消毒剂《中国药典》推荐使用浓度为体积分数 70% ～ 75% ，在复配消毒剂中作为增效或增溶剂并没有限定使用浓度。

在最新修订颁布的国家推荐标准 GB/T 26373 － 2020 《醇类消毒剂卫生标准》推荐乙醇 ( 含异丙醇和复合醇 ) 使用浓度≥体积分数 60% 或雷竞技百科分数 50% 。实际使用中，以乙醇为主要成分的快速手消毒剂的乙醇含量在 60% ～ 90% ，有的快速手消毒剂乙醇含量甚至更低。但是，关于不同浓度乙醇溶液的定量杀菌效果的报道很少见到。

为此，本研究采用悬液定量杀菌试验法，对浓度为体积分数 35% 以上不同浓度乙醇溶液进行了杀菌效果观察。现将观察结果报告如下。

1、材料和方法

1.1 试验材料试验用乙醇溶液为分析纯无水乙醇，乙醇含量≥ 99.7% ，国内市售产品 ; 稀释用水无菌标准硬水，试验时按体积分数配制成系列百分浓度。试验指标菌有金黄色葡萄球菌 (ATCC 6538) 、大肠杆菌 (8099) 和白色念珠菌 (ATCC 10231) ，均由中国菌种保藏中心提供。试验用生化试剂及培养基均为国内市售成品，中和剂用 D/E 肉汤，市售产品。

1.2 试验方法

1.2.1 菌悬液制备取标准菌株培养分纯的典型菌落接种于营养培养基斜面，经 37 ℃培养 18 ～ 24h ，用胰蛋白胨生理盐水 (TPS) 洗下斜面上菌苔，转移到无菌试管中，经充分震荡混匀，用 TPS 稀释成所需的浓度备用。试验时，将菌悬液与 30g/L 的牛血清白蛋白作对倍混合。微菌量法 : 将菌悬液与 300g/L 的牛血清白蛋白对倍混合。

1.2.2 中和剂鉴定试验取灭菌后的 D/E 中和肉汤水溶液，并依据 2002 年版《消毒技术规范》规定的悬液定量试验程序进行了中和剂效果鉴定，试验证明有效，试验操作和结果均省略。

1.2.3 常规悬液定量杀菌试验试验在 20 ℃水浴条件下进行，首先对试验用乙醇溶液和菌悬液均恒温 5min 。在无菌试管内加入菌悬液 1.0 mL 和 4.0mL 某浓度乙醇溶液 ( 阳性对照为 TPS) ，混合计时。作用至预定时间，吸取 0.5mL 混合样液加入到含有 4.5 mL 中和剂的试管中，混匀中和作用 10 min 。然后用混匀的样液以平板倾注法接种培养，做活菌培养计数，计算杀灭对数值。所有试验重复 3 次。

1.2.4 微菌量法悬液定量杀菌试验在无菌试管内加入菌悬液 0.1 mL 和某浓度乙醇溶液 4.9mL( 阳性对照为 TPS) ，混合计时。以下操作同上述常规悬液定量杀菌试验。

2、结果

2.1对金黄色葡萄球菌杀灭效果结果表明，浓度为45%～90%范围的乙醇溶液作用3min，对金黄色葡萄球菌杀灭对数值＞5.0；浓度≤40%或≥95%的乙醇溶液作用3min，对金黄色葡萄球菌杀灭对数值均≤5.0(表1）

2.2对大肠杆菌杀灭效果结果显示，浓度为40%～98%范围的乙醇溶液作用1min，对大肠杆菌杀灭对数值均＞5.0；浓度为35%的乙醇溶液作用3min，对大肠杆菌杀灭对数值均＜3.0(表2)。

2.3对白色念珠菌杀灭效果结果表明，浓度为45%～98%范围的乙醇溶液作用2min，对白色念珠菌杀灭对数值均＞5.0；40%的乙醇溶液作用2min，对白色念珠菌的平均杀灭对数值为3.28；浓度为35%的乙醇溶液作用3min，对白色念珠菌杀灭对数值均＜3.0(表3)。

3、讨论

乙醇为有机化合物，结构简式 CH3CH2OH 或 C2H5OH ，俗称酒精，是最常见的一元醇。在常温常压下是一种易燃、易挥发的无色透明液体，低毒性，有刺激的辛辣滋味。易燃，其蒸气能与空气形成爆炸性混合物，能与水以任意比互溶。能与氯仿、乙醚、甲醇、丙酮和其他多数有机溶剂混溶，相对密度 0.816 。

乙醇消毒剂的杀菌机制是 :

①使蛋白质变性。乙醇分子进入蛋白质分子的肽链，使蛋白质变性沉淀。

②破坏细菌细胞壁。乙醇分子以自由扩散的方式迅速渗透到菌体内，使细菌细胞破坏溶解。

③对微生物酶系统的破坏。通过抑制酶系统，特别是脱氢酶和氧化酶等，阻碍其正常代谢。

浓度范围 70% ～ 80% 的乙醇更容易进入菌体细胞内，能迅速杀菌。因为无水或过高浓度的乙醇溶液使菌体细胞迅速脱水，导致菌体表面蛋白质凝固，在菌体表面形成保护膜，阻止乙醇进入细胞，阻碍杀死菌体 ; 过低浓度的乙醇溶液，因为乙醇浓度过低，杀菌能力会迅速减弱，甚至无杀菌效果。所以乙醇浓度过高或过低时都会影响其杀菌效果。

关于 75% 乙醇溶液的杀菌效果报道很多，但是其他浓度的乙醇溶液的定量杀菌效果报道很少。试验中定量检测了不同浓度乙醇溶液的杀菌效果。试验中发现，悬液定量杀菌试验中， 45% ～ 90% 的乙醇溶液对金黄色葡萄球菌有效， 40% ～ 98% 的乙醇溶液对大肠杆菌和白色念珠菌有效； 95% 及以上浓度和 40% 及以下浓度的乙醇溶液对金黄色葡萄球菌杀菌效果不符合标准要求， 35% 及以下浓度的乙醇溶液对大肠杆菌和白色念珠菌杀菌效果不符合标准要求。

所以，从试验结果得出 : 乙醇的最高有效杀菌浓度为 90% ，最低有效杀菌浓度为 45% 。 30% 及以下浓度的乙醇溶液作用 3min 对试验菌的杀灭作用很微弱。

试验中发现，与 75% 乙醇消毒剂相比，更低浓度的乙醇溶液仍然能有效杀灭细菌和真菌，这个数据对以乙醇为主要杀菌成分或复配成分的消毒剂生产有指导意义。

一般认为，对于相同的消毒剂，真菌比细菌的耐受性更强，但是试验中发现，对于乙醇溶液，白色念珠菌比金黄色葡萄球菌更敏感，这一现象与含氯类消毒剂、过氧乙酸消毒剂和过氧化氢消毒剂有区别。因为《消毒技术规范》提出在进行试验时首选悬液法，所以试验中采用悬液法进行定量杀菌试验。从乙醇消毒液的使用场景出发，载体法的杀菌试验，有待进一步研究。

文章来源：微生物检验之家，