3.4.1
试样提取
此法适用于包含原生和添加生物素的样品提取。例如婴幼儿配方食品、谷物类等制品。准确称取适量试样(
m
),约含
0.2
~
0.5
μ
g
生物素,精确至
0.001g
。以婴幼儿配方奶粉为例,可以根据添加量计算称样量和稀释倍数,最终把浓度控制在
0.01
~
0.1ng/mL
范围内。
称一定量样品至一个
250mL
锥形瓶中,加
100mL
硫酸溶液,于
121
℃高压水解
30min
,试样取出后冷却。用氢氧化钠溶液调节
pH
至
4.5
±
0.2
,转到
250mL
容量瓶中,用水定容,充分混合。
用滤纸过滤,弃去最初的几毫升。吸取滤液
5mL
,加入约
20mL
水,用氢氧化钠溶液调节
pH
为
6.8
±
0.2
。转至
100mL
容量瓶中,用水定容至刻度。所以样品的称量数取决于对样品中生物含量的预估,使最终试样稀释后生物素浓度控制在
0.01
~
0.1ng/mL
范围内即可。
3.4.2
质控
准确称取适量已知浓度的标样,约含
0.2
~
0.5
μ
g
生物素,精确值
0.001g
,后续处理方法同样品。
3.4.3
加标回收
准确称取适量试样,约含
0.2
~
0.5
μ
g
生物素,精确值
0.001g
,加入含等量生物素的标准溶液,后续处理方法同样品。
3.4.5
试样稀释
如果需要,进行适度稀释,使试样稀释液中生物素含量最终控制在
0.01
~
0.1ng/mL
范围内。
3.4.6
测定系列管制备
取四支试管,分别加入
1ml
、
2ml
、
2ml
、
4ml
试样提取液,即为
Vx
,补水至
5mL
。加入
5mL
生物素测定用培养液,混匀,每个梯度做
3
个平行。如表
1
所示。
3.4.7
标准系列管制备
如表
2
所示。取试管分别加入生物素标准工作溶液、水和培养液,混匀,每个梯度做
3
个平行。绘制标准曲线时,以每点平均值计算。
将上述试管盖上试管帽,包括标准系列管和试样系列管,于
121
℃高压灭菌
5min
,取出快速冷却至室温,备用。
3.4.8
培养
在无菌条件下,用移液器或无菌针管向每只测定管接种
1
滴接种液,其中标准曲线管中未接种空白和样品空白不接种。置于
37
±
1
℃恒温培养箱中培养
19-20h
,直至获得最大浑浊度,即在培养两小时透光率无明显变化。
3.4.9
测定
将培养好的测定管用涡漩混匀器混匀。用厚度为
1cm
的比色杯,于
550nm
处,以接种空白管调节透光率为
100%
,然后依次测定标准系列管和试样系列管的吸光度值。如果未接种空白对照有明显的细菌增长,说明可能有杂菌混入,需重做试验。
3.5
结果分析
3.5.1
绘制标准曲线
以标准系列管生物素含量为横坐标,每个标准点吸光度值均值为纵坐标,绘制标准曲线。
3.5.2
样液结果计算
从标准曲线上的公式计算出试样系列管中生物素的相应含量
Cx
。如果每个试样的
3
个测试管中有
2
个值落在
0.01ng
~
0.1ng
范围内,且每个测试管之间吸光值偏差小于
10%
,则按式(
1
),式(
2
)进行结果计算。
四、
生物素检验系统成立
.1
质控标样的检测结果应符合说明书给出的检测范围;
.2
加标回收率在
90%
~
110%
;
33
在重复性条件下获得的两次独立的测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的
10%
。
.4
线性范围是指利用一种方法取得精密度、准确度均符合要求的试验结果,而且成线性的供试物浓度的变化范围,其最大量与最小量之间的间隔,可用
mg/L-mg/L
、μ
g/mL-
μ
g/mL
等表示。
检出限是方法能检出某物质时的最低浓度。
定量限是方法能准确定量出某物质时的最低浓度。
本方法线性范围为
0.01
μ
g/mL-0.1
μ
g/mL
,检出限为
2.0
μ
g/100g
,定量限为
4.0
μ
g/100g
五、注意事项
1
试验玻璃器皿专用。微生物法测定维生素的要求较高,所以实验室所有玻璃器皿要与其他微生物试验区分开。注意所有玻璃器皿要仔细清洗。
2
整个试验操作要避免微生物污染和外来生物素污染,所以操作要格外注意。
3
保证标准菌株活力。标准菌的活力对试验结果影响很大,一定要按标准规定对标准菌株进行传代,保证活力。
4
把握好培养终止时间。要密切监测最高浓度试管的浑浊度,一旦出现最大混浊度要立刻终止培养开始测定吸光度。
5
稀释定容一定要准确。标准品和试样都会进行高倍数稀释,所以一定要准确,避免误差过大。
本文摘录于原国家食品药品监督管理总局(现国家市场监督管理总局)科技和标准司、中国食品药品检定研究院、河北省食品检验研究院发布的《食品安全国家标准实操视频》,版权归其所有。本次文字整合仅限交流学习使用,不做任何商业用途。
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