饲料中4种黄曲霉毒素的检测

王中泰

饲料中 4 种黄曲霉毒素的检测

通量自动化免疫磁珠净化 - 超高效液相色谱法检测饲料中 4 种黄曲霉毒素

摘要 ABSTRACT

黄曲霉毒素 (AFT) 是一种毒性极强的剧毒物质 , 具有致癌性。饲料原料及产品在生产、运输和储藏等过程存在被黄曲霉毒素污染的风险。该文建立了高通量自动化免疫磁珠净化 - 超高效液相色谱法测定饲料中 4 种黄曲霉毒素 ( 黄曲霉毒素 B1(AFB1) 、黄曲霉毒素 B2(AFB2) 、黄曲霉毒素 G1(AFG1) 和黄曲霉毒素 G2(AFG2)) 的分析方法。饲料样品用乙腈 - 水 (70 ∶ 30, v/v) 提取 , 经免疫磁珠自动净化后 , 使用超高效液相色谱进行分析测试。对磁珠与抗体的偶联比例、免疫磁珠与黄曲霉毒素的反应时间、样品提取液和稀释液等关键实验条件进行了优化 , 考察了不同饲料样品的净化效果。

在优化条件下 , 豆粕、玉米干酒糟及其可溶物、猪饲料和鸡饲料等 4 种常见饲料样品在 3 个水平 (5 、 20 和 40 μg/kg, 以 AFB1 计 ) 下的加标回收率在 91.1%~119.4% 之间 , 相对标准偏差小于 6.9%; 日间精密度为 4.5%~7.5%, 该方法具有良好的重复性。采用该法检测雷竞技百科 控制样品中 AFB1 的含量 , 平均值为 18.6 μg/kg(n=3), 准确度为 110.3%, 测试结果满意。使用该法测试了 21 种随机购买的饲料样品 , 其中有 4 份样品测出含有 AFB1 。

本方法所使用的自动净化系统能够自动净化饲料中的 4 种黄曲霉毒素 , 并实现样品的批量处理 , 每批可最多同时净化 24 个样品 , 批处理总用时约为 30 min; 超高效液相色谱法分析速度快 , 准确性高 , 可用于检测饲料中黄曲霉毒素的含量。

一、免疫磁珠的制备

将磁珠充分混匀 , 准确吸取 1 mL 磁珠于离心管中 , 磁分离后弃去上层液 , 用无水乙醇快速清洗磁珠 2 次。用 MES 缓冲液 (100 mmol/L, pH=6.0) 稀释 2.0 mg 的黄曲霉毒素单克隆抗体 , 混匀后快速加入到清洗完成的磁珠中 , 在室温下振荡孵育 2 h 。孵育结束后 , 磁分离后弃去上层液 , 加入封闭液 (2% 甘氨酸 ), 在室温下振荡反应 2 h, 封闭结束后进行磁分离 , 然后弃去上层液 , 使用含 0.1% 吐温 -20 的 PBS 和 PBS 分别清洗 3 次。黄曲霉毒素免疫磁珠保存在 PBS 中 ,4 ℃ 冷藏储存。免疫磁珠的制备示意图如图 1a 所示。

图 1 (a) 黄曲霉毒素免疫磁珠的制备示意图和 (b) 免疫磁珠自动净化系统工作流程示意图

二、样品中黄曲霉毒素的提取和免疫磁珠净化

饲料样品经粉碎、混匀后 , 准确称取 5.00 g(±0.01 g) 于 50 mL 离心管中 , 加入 20 mL 乙腈 - 水 (70 ∶ 30, v/v), 充分涡旋提取 20 min, 以 8000 r/min 离心 5 min, 使固液分离。吸取 1 mL 上层液移入事先加入含 0.5% 吐温 -20 的 PBS 的试剂盒样品孔中 , 将试剂盒放到免疫磁珠自动净化系统内进行净化 ( 见图 1b) 。通过磁棒将 100 μL 免疫磁珠转移至试剂盒样品孔中 , 振荡反应 2.0 min 。通过磁棒将免疫磁珠转移至含 1 mL PBS 的清洗孔振荡清洗 1.0 min, 重复两次。通过磁棒将免疫磁珠转移至含 0.5 mL 甲醇的洗脱孔振荡洗脱 1.0 min, 最后通过磁棒磁吸后弃去免疫磁珠。净化结束后 , 向洗脱孔中加入 0.5 mL 水 , 混匀后用 0.22 μm 有机滤膜过滤后收集在进样瓶中 , 上机检测。

三、色谱条件

色谱柱 :Waters BEH-C18 色谱柱 (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm); 柱温为 40 ℃ , 样品温度为 10 ℃ ; 进样量为 10 μL; 流动相为甲醇 - 乙腈 - 水 (17.5 ∶ 17.5 ∶ 65, v/v/v), 等度洗脱 ; 流速为 0.2 mL/min 。荧光检测器的激发波长为 360 nm, 发射波长为 440 nm 。

文章信息 INFORMATION 色谱 , 2023, 41(6): 504-512
1. 国家粮食和物资储备局科学研究院粮油雷竞技百科 安全研究所 , 北京 102629

2. 上海理工大学健康科学与工程学院 , 上海 200093

3. 江西省农业技术推广中心 , 江西 南昌 330046