蛋白质浓度测定方法大全

王中泰

蛋白质浓度测定方法大全

蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品雷竞技百科 检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。

蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法带来了许多具体的困难。目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：

物理性质：紫外分光光度法。
化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、 Lowry 法， BCA 法，胶体金法。
染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法。
其他性质：荧光法。

蛋白质测定的方法很多，但每种方法都有其特点和局限性，因而需要在了解各种方法的基础上根据不同情况选用恰当的方法，以满足不同的要求。例如凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，用于大批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量大，测量范围窄，因此在科研上的应用受到限制；而酚试剂法弥补了它的缺点，因而在科研中被广泛采用，但是它的干扰因素多；考马氏亮兰染色法因其灵敏而又简便开始重新受到关注； BCA 法又以其试剂稳定，抗干扰能力较强，结果稳定，灵敏度高而受到欢迎；胶体金法具有较高的灵敏度，可达到毫微克水平，用于微量蛋白的测定。

一、常用的测定蛋白质含量方法的比较

下面介绍 Folin —酚试剂法，考马氏亮蓝 G — 250 染色法，紫外分光光度法、胶体金法等几种最常用使用的方法。

二、、 Folin －酚试剂法（又名 Lowry ）法
1 、、实验原理

这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即 Folin —酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin —酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。在生物化学领域得到广泛的应用。

此法可检测的最低蛋白雷竞技百科 达 5mg 。通常测定范围是 20~250mg 。

2. 、优缺点

优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多；

缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。

3 、试剂与器材

3 、 1. 试剂

（ 1 ）试剂甲：（ A ） 10 克 Na2CO3 ， 2 克 NaOH 和 0.25 克酒石酸钾钠（ KNaC4H4O6 · 4H2O ），溶解于 500 毫升蒸馏水中。（ B ） 0.5 克硫酸铜（ CuSO4 · 5H2O ）溶解于 100 毫升蒸馏水中，每次使用前，将 50 份（ A ）与 1 份（ B ）混合，即为试剂甲。

（ 2 ）试剂乙：在 2 升磨口回流瓶中，加入 100 克钨酸钠， 25 克钼酸钠及 700 毫升蒸馏水，再加 50 毫升 85% 磷酸， 100 毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流 10 小时，回流结束时，加入 150 克硫酸锂， 50 毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾 15 分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至 1 升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准 NaOH 滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水 1 倍，使最终的酸浓度为 1N 左右。

（ 3 ）标准蛋白质溶液 : 精确称取结晶牛血清清蛋白或球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为 250 mg/ml 左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用 0.9 % NaCl 溶液。

3 、 2. 器材

（ 1 ）可见光分光光度计；

（ 2 ）旋涡混合器；

（ 3 ）秒表；

（ 4 ）试管 16 支。

4 、操作方法

4 、 1. 标准曲线的测定：取 16 支大试管， 1 支作空白， 3 支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入 0 ， 0.1 ， 0.2 ， 0.4 ， 0.6 ， 0.8 ， 1.0 毫升标准蛋白质溶液（浓度为 250mg/ml ）。用水补足到 1.0 毫升，然后每支试管加入 5 毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（ 20 ～ 25 ℃）放置 10 分钟。

再逐管加入 0.5 毫升试剂乙（ Folin —酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置 30 分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于 700nm 处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。注意：因 Lowry 反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第 1 支试管加入 5 毫升试剂甲后，开始计时， 1 分钟后，第 2 支试管加入 5 毫升试剂甲， 2 分钟后加第 3 支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过 10 分钟，则第 1 支试管可立即加入 0.5 毫升试剂乙， 1 分钟后第 2 支试管加入 0.5 毫升试剂乙， 2 分钟后加第 3 支试管，余此类推。

待最后一支试管加完试剂后，再放置 30 分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。进行多试管操作时，为了防止出错，必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。

4 、 2. 样品的测定：取 1 毫升样品溶液（其中约含蛋白质 20~250 微克），按上述方法进行操作，取 1 毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加 3 个试管。如上表中的 8 、 9 、 10 试管。根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白雷竞技百科 ，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。

5 、注意事项

（ 1 ）对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰 Lowry 反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、 Tris 缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（ 0.5% ），硫酸钠（ 1% ），硝酸钠（ 1% ），三氯乙酸（ 0.5% ），乙醇（ 5% ），乙醚（ 5% ），丙酮（ 0.5% ）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。

（ 2 含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度 1~2 倍。进行测定时，加 Folin —酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性 pH 条件下稳定，但上述还原反应只在 pH=10 的情况下发生，故当 Folin 一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

三、考马斯亮蓝法
1 、实验原理

考马斯亮蓝 (Coomassie Brilliant Blue) 法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量测定微量蛋白浓度快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。目前，这一方法是也灵敏度最高的蛋白质测定法之一。

考马斯亮蓝 G-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰 (lmax) 的位置，由 465 nm 变为 595 nm ，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。通过测定 595 nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸 ( 特别是精氨酸 ) 和芳香族氨基酸残基相结合。

王中泰

2、优缺点
优点：（
1）灵敏度高，据估计比 Lowry 法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达 1 mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry 法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要 5 分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要 2 分钟即可完成，其颜色可以在 1 小时内保持稳定，且在 5 分钟至 20 分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像 Lowry 法那样费时和需要严格地控制时间。
（3）干扰物质少。如干扰 Lowry 法的 K+、Na+、Mg2+ 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。

缺点
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠 (SDS) 等。

3、试剂与器材
3、1、试剂
考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝 G-250 100 mg 溶于 50 mL 95% 乙醇中，加入 100 mL 85% 磷酸，用蒸馏水稀释至 1000 mL
3、2、标准和待测蛋白质溶液
（1）标准蛋白质溶液结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用 0.15 mol/L NaCl 配制成 1 mg/mL 蛋白溶液。
（2）待测蛋白质溶液，人血清，使用前用 0.15 mol/L NaCl 稀释 200 倍。
3、3、器材
试管 1.5×15 cm（×6）；
试管架；
移液管管 0.5 mL（×2）;1 mL（×2）;5 mL（×1）；
恒温水浴；
分光光度计。
4、操作方法
4、1、制作标准曲线
取 7 支试管，按下表平行操作。
摇匀，1 h 内以 0 号管为空白对照，在 595 nm 处比色。
绘制标准曲线：以 A595 nm 为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
4、2、未知样品蛋白质浓度测定
测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的 A595 nm 值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。

5、注意事项
（1）在试剂加入后的 5-20 min 内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
（3）利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。

四、BCA法
1、实验原理
BCA检测法是Lowry测定法的一种改进方法。与Lowry方法相比，BCA法的操作更简单，试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度更高（微量检测可达到0.5μg/ml），应用更加灵活。 蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与Cu2+络合生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和Cu+结合生成深紫色的化合物，这种稳定的化合物在562nm处具有强吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色的方法确定蛋白质的含量。

2、该方法的优点
(一) 操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的Lowary法快4倍且更加方便；
(二) 准确灵敏，试剂稳定性好，BCA试剂的蛋白质测定范围是20-200μg/ml，微量BCA测定范围在0.5-10μg/ml。
(三) 经济实用，除试管外，测定可在微板孔中就进行，大大节约样品和试剂用量；
(四) 抗试剂干扰能力比较强，如去垢剂，尿素等均无影响 。

3、实验材料
3、1.实验器材
721分光光度计；
恒温水浴槽；
移液管；
微量进样器；
试管架和试管。
3、2.实验试剂

(1) BCA试剂的配制
① 试剂A，1L：分别称取10g BCA (1%)，20g Na2CO3?H2O (2%)，1.6g Na2C4H4O6?2H2O(0.16%)，4g NaOH (0.4%) ，9.5g NaHCO3 (0.95) ，加水至1L，用NaOH或固体NaHCO3调节pH值至11.25。

② 试剂B，50ml：取2g CuSO4?5H2O (4%)，加蒸馏水至50ml。 ③ BCA试剂：取50份试剂A与1份试剂B混合均匀。此试剂可稳定一周。
(2)标准蛋白质溶液：称取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水中并定容至100ml，制成400μg/ml的溶液。
(3)样品溶液：配制约50μg/ml的牛血清白蛋白溶液作为样品。

4、实验方法
方法一：96 孔板
4、1. 配制 BCA 工作液：根据标准品和样品数量，按 50 体积试剂
A、1 体积试剂
B 、配制适量 BCA 工作液。充分混匀。

4.2. 将蛋白标准品按 0 μL，1 μL，2 μL，4 μL，6 μL，8 μL，10 μL 加入 96 孔板的蛋白标准品孔中。加灭菌双蒸水补足到 10 μL。取 10 μL 待测样品加入 96 孔板的待测样品孔中。每个测定要做 2～3 个平行。
4.3. 向待测样品孔和蛋白标准品孔中各加入 200 μL BCA 工作液（即样品与工作液的体积比为 1:20），混匀。
4、4. 37 ℃ 温浴 30 min。冷却至室温。/4、5. 酶标仪 562 nm 波长下测定吸光度。
4、6. 制作标准曲线。从标准曲线中求出样品浓度。

方法二：试管法
1. 配制工作液：根据标准品和样品数量，按 50 体积试剂 A，1 体积试剂 B 配制适量 BCA 工作液，充分混匀。工作液配制的量要与测定所用的比色杯对应。每个测定要做 2～3 个平行。本处列举的比色体系所用的是 0.5 mL 的比色杯。如比色杯规格不同，体系需要放大到实验将采用的比色杯准确读数所需要的体积。

2. BSA 标准品和样品的准备：样品用水或其它不干扰显色反应的缓冲液配制，使待测定的浓度位于标准曲线的线性部分。每个反应准备
3 个平行测定。标准曲线一般 5~6 个点即可。根据样品的估测浓度确定各点的具体浓度。稀释 BSA 时可以用水或与样品一致的溶液。如待测样品的浓度约为 200 μg/mL，可按下表的次序加入 BSA 标准品、样品及 BCA 工作液。
3. 取适量体积的标准蛋白，以蛋白液：工作液=1:20 的比例混匀。37 ℃ 温浴 30 min。冷却至室温。
4. 将样品与标准品在 562 nm 波长下测定吸光度。

五、紫外分光光度计法
1、实验原理
这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白 质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受 到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。

2、结果计算
（1）简易经验公式
蛋白质浓度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor
（2）精确计算
通过计算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通过如下公式计算最终结果：
蛋白质浓度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D
其中d为测定OD值比色杯的厚度
D为溶液的稀释倍数

yujiansp

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