你离“理想”的标准曲线，只差这几步细节

王中泰

你离“理想”的标准曲线，只差这几步细节

分析检测中绘制标准曲线目的是可以根据标准曲线查出待测物质的含量，所以标曲的制定是实验室工作中必不可少的工作。而在真实的实验过程中，制作标注曲线往往与理想中的不一样，比如标注曲线弯曲、线性不够好等问题，造成这样情况的原因是什么？本期我们整理了标准曲线制作的要点，希望对大家有所帮助！

目录

1. 制作标曲的标准依据

2. 标曲制作中需把控哪些重点

3. 标曲制作中可改善哪些细节

一、制作标曲的标准依据

对于分析定量来说，如果标准曲线没有做好，那么即使前处理做的再好，回收率再好，也会使你的结论失去一定的参考价值！也失去了与其他人员测试数据的可比性！所以，如何搞定标准曲线，是大家要不断精进提升的地方。

在 GB/T22554-2010 《基于标准样品的线性校准》中：
（ 1 ）标准曲线的浓度范围应覆盖正常操作条件下的被测量范围；
（ 2 ）标准样品的组分尽量与被测样品组分一致；
（ 3 ）标准样品的浓度值应等距离的分布在被测量范围；
（ 4 ）标准样品的个数至少应有 3 个浓度；
（ 5 ）每个标准点至少重复测量 2 次，这个重复是指从稀释开始。

注意：如果国家标准有相应的浓度系列推荐，尽量按国家标准。工作中我们经常采用线性校准，因为线性方程最为简洁。

二、标曲制作中需把控哪些重点

1. 标准液的浓度

在制备标准曲线时，标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能变异最低与最高值，一般是做 5 个点，但至少应有 3 个点。

标准曲线具体需要几个数据点，是与所检测组分的浓度范围、分析仪响应特性、干扰因素、浓度与检测信号响应类型有关的。

3 个点：

对于一些低浓度，特别是微量分析，并且浓度范围不是很大的，检测器响应可靠，背景干扰非常小的，则可以选用较少的工作点就行，一般有 3 个浓度点就足够了，有些甚至可以只用一个浓度点就行，另一个点直接用坐标原点。

4~6 个点：

对于平时测量的样品浓度范围较宽，并且检测器响应不完全是一次曲线（直线）的，可以采用二次曲线或分段校正方式，以减少数据偏差，这种情况就需要多用几个数据点，如果不分段，数据点有 4~6 个就够用。

至少两个点：但如果是分段校正，则每段需要至少两个数据点。而对于一些样品无浓度范围规律的，特别是一些检测机构，如果分析仪的检测响应可靠，环境因素影响少的，可以做校正曲线。若是环境因素影响大的，则不必做校正曲线，而采用标准加入法或标准加入——一次稀释法反而简便一些。

实际操作上：以理化分析实验为例，我们一般是做五个点（不包括零浓度）；一般以检出限的 5~10 倍为第一个点，以后根据 1 倍递增，最高浓度是最低浓度的 10~20 倍为宜。当然，要根据仪器的灵敏度来调整。

2. 标准液的测定

以比色测定为例，在比色时，读取光密度至少读 2-3 次，求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。

3. 标准曲线图的绘制

一般常用的是光密度——浓度标准曲线。

（ 1 ）用普通方格纸作图。图纸最好是正方形 ( 长：宽 =1 ： 1) 或长方形 ( 长：宽 =3 ： 2) ，以横轴为浓度，纵轴为光密度，一般浓度的全距占用了多少格，光密度的全距也应占用相同的格数；

在适当范围内配制各种不同浓度的标准液，求其光密度，绘制标准曲线，以浓度位置向上延长，光密度位置向右延长、交点即为此座标标点。然后，将各坐标点和原点联成一条线，若符合 Lambert-Beer 氏定律，则系通过原点的直线；

（ 2 ）若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通过更多点，使不在直线上的点尽量均匀地分布在直线的两边；

（ 3 ）标准曲线绘制完毕以后，应在座标纸上注明实验项目的名称，所使用比色计的型号和仪器编号、滤光片号码或单色光波长以及绘制的日期、室温；

（ 4 ）绘制标准曲线：一般应作二次或三次以上的平行测定，重复性良好曲线方可应用；

（ 5 ）绘制好的标准曲线只能供以后在相同条件下操作测定相同物质时使用。当更换仪器、移动仪器位置、调换试剂及室温有明显改变时，标准曲线需重新绘制；

（ 6 ）标准曲线横坐标的标度：从标准液的含量换算成待测液的浓度。

4. 标准曲线的检验

线性检验：即检验校准曲线的精密度。对于以 4 ～ 6 个浓度单位所获得的测量信号值绘制的校准曲线，分光光度法一般要求其相关系数 |r| ≥ 0.9990 ，否则应找出原因并加以纠正，重新绘制合格的校准曲线。

截距检验：即检验校准曲线的准确度，在线性检验合格的基础上，对其进行线性回归，得出回归方程 y=a+bx ，然后将所得截距 a 与 0 作 t 检验，当取 95% 置信水平，经检验无显著性差异时， a 可做 0 处理，方程简化为 y=bx ，移项得 x=y/b 。在线性范围内，可代替查阅校准曲线，直接将样品测量信号值经空白校正后，计算出试样浓度。

当 a 与 0 有显著性差异时，表示校准曲线的回归方程计算结果准确度不高，应找出原因予以校正后，重新绘制校准曲线并经线性检验合格。在计算回归方程，经截距检验合格后投入使用。

回归方程如不经上述检验和处理，就直接投入使用，必将给测定结果引入差值相当于解决 a 的系统误差。

斜率检验：即检验分析方法的灵敏度，方法灵敏度是随实验条件的变化而改变的。在完全相同的分析条件下，仅由于操作中的随机误差导致的斜率变化不应超出一定的允许范围，此范围因分析方法的精度不同而异。例如，一般而言，分子吸收分光光度法要求其相对差值小于 5% ，而原子吸收分光光度法则要求其相对差值小于 10% 。

5. 标曲 R 值几个 9 合格

标曲 R 值大于 0.99 是判断是否为线性相关的一个标准，实际应用中线性大于 0.999 才是比较理想的。线性在 0.99 到 0.999 之间的监测结果只用接近最高浓度一半（中间浓度）的位置才比较准确，如果线性大于 0.999 的话，在整个线性范围内都会有一个比较满意的结果。

如果检测的线性不好，可以减少标准的覆盖范围，将标准的浓度调整到待测样品浓度附近，这样结果也是非常准确的。

例如：样品的浓度约 20ppb ，但在 0~50ppb 范围建立标准曲线，但线性非常不理想，这时可以将标准范围调整到 15~25ppb 之间，作五个标准。

6. 标曲有效期的规定

(1) 标准曲线属于实验室雷竞技百科 控制的范围，按照《实验室资质认定评审准则》中结果控制的要求：定期使用有证标准物质（参考物质）进行监控或使用次级标准物质（参考物质）开展内部雷竞技百科 控制。

(2) 准则中并未对“定期”进行规定，所以如果“定期”，就根据实验室的实际情况来定。

(3) 根据一般的分析教材，当实验条件（包括药剂、人员、仪器等）发生变化时，最好重新制作标准曲线。一般来说仪器如果长期使用，并经过检定，是处于稳定状态，而人员药剂的变化往往会较大。如果说每次换个人操作都要换曲线，那工作量太大了。

三、标曲制作中可改善的细节

标准曲线法特别适合于大量样品的分析，但由于每次样品分析的色谱条件（检测器的响应性能、柱温、流动相流速及组成、进样量、柱效等）很难完全相同，因此容易出现较大误差。

此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品），而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差。

了解各个分析项目校准曲线斜率的稳定性及影响稳定性的主要因素，可决定是否能采用带标点检验原校准曲线，省略重新制作校准曲线；从校准曲线斜率的变化，可判断标准溶液的稳定性，从而确定其标定周期；分析低浓度样品时，应使用高纯度的水和试剂，以减少空白值，降低样品的分析误差。

1. 选取有证书的标准物质

选取有证书的标准物质是为了大家都有一个共同的基准。如果实在是在没有有证书的标准物质，就用有证书的其他物质来配置。保证标准品的纯度，所用标准品最好是新打开的，防止污染。

2. 器具均经过校验

在配置时要把所有要用到的量具（容量瓶、移液枪、移液管等）、测量仪器均进行计量检定或校准，最好拿到国家计量中心或有资质的部门校正。有校正能力的实验室也可自己校正。

3. 防止污染操作精准

要洗净所要用到的工具。对于离子色谱来说，主要使用去离子水清洗。移取液体时体积要精确，尽可能用一根移液管；为减小人为误差，同一种液体要一个人操作。

4. 配制好标液后及时上机

避免有的物质不稳定或易被污染，但在常规实验室中也只有常规分析的时候，相对比较容易些，而现目前不少实验项目均要求检测 ppb 级含量的物质。

5. 选取合适的方程

根据物质的和检测器的特性，选取合适的线性方程（比如是否要强制过原点，是直线还是二次方程等）。

6. 确保标线的准确性

除仪器自身的回收率、响应值等相关外，另外我们可以做到：

（ 1 ）不同的人员配置标线和 QC ；

（ 2 ）参加实验室间的比对或能力验证；

（ 3 ）使用相同或不同方法进行重复检测或校准；

（ 4 ）对存留物品进行再检测或再校准。

7. 标线使用寿命确认

合格后，需注意标线的“有效期”。一般是根据检测的频率来确认，如果该项目天天都要检测，并且检测量较多时，要求至少每周做一次曲线。如果检测量上，一个月只检测几次，就一个月做一次曲线。

注意：仪器如果出现故障并维修回来的，经过检定后，需要重新做曲线。

猫了个猫

我看标题，还以为是减肥后的身材曲线