酶联免疫吸附试验检测LT
和ST
LT检测方法(双抗体夹心法):(1)包被:先在产肠毒素大肠埃希氏菌LT和ST酶标诊断试剂盒中取出包被用LT抗体管,加入包被液0.5mL,混匀后全部吸出于3.6mL包被液中混匀,以每孔100μL量加入到40孔聚苯乙烯硬反应板中,第一孔留空作对照,于4℃冰箱湿盒中过夜。(2)洗板:将板中溶液甩去,用洗涤液I洗3次,甩尽液体,翻转反应板,在吸水纸上拍打,去尽孔中残留液体。(3)封闭:每孔加100μL封闭液,于37℃水浴中1h。(4)洗板:用洗涤液Ⅱ洗3次,操作同上。(5)加样本:每孔分别加各冲试验菌株产毒培养液100μL,37℃水浴中1h。(6)洗板:用洗涤液Ⅱ洗3次,操作同上。(7)加酶标抗体:先在酶标LT抗体管中加0.5mL稀释液,混匀后全部吸出于3.6mL稀释液中混匀,每孔加100μL,37℃水浴中1h。(8)洗板:用洗涤液Ⅱ洗3次,操作同上。(9)酶底物反应:每孔(包括第一孔)各加基质液100μL,室温下避光作用5~10min,加入终止液50μL。(10)结果判定:以酶标仪在波长492nm下测定吸光度OD值,待测标本OD值大于阴性对照3倍以上为阳性,目测颜色为桔黄色或明显高于阴性对照为阳性。
ST检测方法(抗原竞争法):(1)包被:先在包被用ST抗原管中加0.5mL包被液,混匀后全部吸出于1.6mL包被液中混匀,以每孔50μL加入于40孔聚苯乙烯软反应板中。加液后轻轻敲板,使液体布满孔底。第一孔留空作对照,置4℃冰箱湿盒中过夜。(2)洗板:用洗涤液I洗3次,操作同上。(3)封闭:每孔,加100μL封闭液,37℃水浴1h。(4)洗板:用洗涤液Ⅱ洗3次,操作同上。(5)加样本及ST单克隆抗体:每孔分别加各试验菌株产毒培养液50μL,稀释的ST单克隆抗体50μL(先在ST单克隆抗体管中加0.5mL稀释液,混匀后全部吸出于1.6mL稀释液中,混匀备用),37℃水浴1h。(6)洗板:用洗涤液Ⅱ洗3次,操作同上。(7)加酶标记兔抗鼠Ig复合物:先在酶标记兔抗鼠Ig复合物管中加0.5mL稀释液,混匀后全部吸出于3.6mL稀释液中混匀,每孔加100μL,37℃水浴1h。(8)洗板:用洗涤液Ⅱ洗3次,操作同上。(9)酶底物反应:每孔(包括第一孔)各加基质液100μL,室温下避光5~10min,再加入终止液50μL。(10)结果判定:以酶标仪在波长492nm下测定吸光度(OD)值:(图略)目测无色或明显淡于阴性对照为阳性。
双向琼脂扩散试验检测LT
:将被检菌株按五点环形接种于Elek氏培养基上。以同样操作,共做两份,于36℃培养48h。在每株菌的菌苔上放多粘菌素B纸片,于36℃经5~6h,使肠毒素渗入琼脂中,在五点环形菌苔各5mm处的中央,挖一个直径4mm的圆孔,并用一滴琼脂垫底。在平板的中央孔内滴加LT抗毒素30μL,用已知产LT和不产毒菌株作对照,于36℃经15~20h观察结果。在菌斑和抗毒素孔之间出现白色沉淀带者为阳性,无沉淀带者为阴性。
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