GB 4789.15-2016 霉菌和酵母计数 霉菌培养中容易污染，实验室该如何解决？

丁丁小果

GB 4789.15-2016 霉菌和酵母计数 已经实施一段时间了，很多小伙伴们在食品雷竞技官网怎么样 中反应采用新版国标霉菌正置培养容易污染，其实新版国标采用正置培养应该更科学准确这个锅不应该由正置培养来背，那污染的可能原因到底是什么呢？ 今天小编就来为大家分析一下这个问题。

GB 4789.15-2016相比GB 4789.15-2010，最大的区别就在于对平皿的培养方式。2016版的国标在5.2中规定：“琼脂凝固后，正置平板，置28℃±1℃培养箱中培养，观察并记录培养至第5d的结果。”

其实针对这一条，需要注意两点：

第一，是需要对平板进行观察的，不能直接培养至第5天计数，因为霉菌的特殊性，在培养过程中会产生大量孢子，导致整个平板蔓延。因此，在培养后的第2天开始，就要对平板进行观察，并计数典型菌落，而这样的观察在之后每一天都应该进行，直至培养第5天。

第二，就是正置培养。这一点是16版国标与旧版最大的区别，10版之前的国标都是倒置培养的。而按照新国标进行正置培养后，很多朋友都遇到了平板被霉菌污染的问题，比如图中的情况，这是什么原因呢？

大家很容易误以为这是因为正置培养导致的，其实不然。造成这种情况的原因有很多种，可能有培养箱环境污染，平皿冷凝水污染，操作环境污染、培养基问题等等，只是正置培养让这些问题更容易显现。这些问题都该如何解决呢？

污染原因与解决措施

一、培养箱环境污染

很多实验室培养霉菌采用的是专用的霉菌培养箱，所以培养箱空间里会有大量的霉菌孢子。而平皿的盖和底是有一定缝隙的，尤其是玻璃平皿缝隙还是比较大的，正置培养中，孢子会向上飞扬通过缝隙落到平板的培养基上，导致污染。细心地实验猿可能发现，污染的菌落大部分都是在平皿边缘生长的。用一次性塑料平皿来培养，污染的概率就会小很多，因为一次性塑料平皿的盖和底之间的缝隙相比之下是比较小的。因此培养箱环境中的孢子可能会是主要污染源。

这样一来，解决的方法就应该是对培养箱进行杀菌。可以考虑用紫外线杀一下菌，同时辅助消毒剂擦拭的方法，常用消毒剂比如75%酒精和新洁尔灭等，应该注意的是，这样的杀菌操作也是需要经常进行的，因为霉菌的孢子是十分难清除的，而每次培养可能又会引进新的污染源，可以考虑每周进行两次，保证培养环境无污染源。

二、平皿冷凝水污染

正置培养过程中，若是平皿的上盖有泠凝水，在培养过程中冷凝水滴落到培养基上，也极容易造成菌落蔓延，平皿污染。因此在培养之前，一定要保证平皿干燥，可以把平皿放在37℃的环境里烘干，烘干之后再进行培养，就会避免这个原因造成的污染。

三、操作环境和培养基的污染

因为无菌室里可能也会因为灭菌效果不理想造成污染。小编之前工作的实验室，操作台使用紫外线灭菌，经常就会灭菌不彻底有孢子污染，尤其是在进行过霉菌的相关检测之后。所以在进行过霉菌检测之后，适当的增长灭菌时间，可能会达到比较理想的效果。另外，为了彻底解决无菌室空间孢子污染的问题，可以购买安装臭氧发生器，通过紫外线+臭氧的双重消毒模式，效果就十分理想了。

大家如果还是想验证一下究竟是什么原因造成的污染，这里提供一个简单的验证试验方法：在正常检测的环境中倒一组空白平皿，将这些平皿分为AB两组，其中A组用封口膜将平皿封好，B组不封，均放置在培养箱中正置培养。若是A组B组均有霉菌生长，则需要考虑培养基污染或者操作环境的污染；若是A组不生长霉菌而B组生长，则需要考虑是培养箱内的环境污染。通过这个小试验，可以基本上确定污染源，然后针对污染源进行相应的处理。

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fenglin1985

这个确实是个问题，上个月 GB 4789.15-2016 实施后我们第一时间就开始按新国标的要求操作，将霉菌培养皿正置，但是5天后发现所有正置的培养皿都长满了霉菌，比对后发现是冷凝水的问题。

楼主对该问题的原因分析和解决措施是很专业的，但是实际上对企业来说实施起来还是比较困难的，
1）企业人工有限，微生物检验现在每批次产品要取样5个检验，公司配备的检验员又不可能有5倍增加，所以现在微生物检验员的工作都是满负荷甚至是超负荷的，不大可能有时间每天对所有霉菌平皿进行检查。
2）企业的霉菌检测是出厂检测，如果无法准确及时得知霉菌结果，公司的产品就无法正常出厂，有些短保质期的产品甚至有无法及时出厂面临报废的风险，而将平皿正置，一旦出现问题，找出原因并及时改善是一方面，另一方面是该产品的霉菌检测得重新做，出厂检测报告无法及时出来，产品无法及时出厂，公司面临的风险是非常大的。

现在我们霉菌检测还是使用倒置的方法，该方法比较稳定，从未发生过大面积污染的情况，但现在还是有两个疑问：1）GB 4789.15-2016 是强制性标准，标准规定的霉菌培养采用正置，采用倒置培养是否有违反食品安全国家标准的嫌疑？
2）正置培养和倒置培养所得出的检测结果是否一致？

白云无尽时

学习了，挺专业的，目前还没遇到这种情况。

陌上花开可归矣

fenglin1985 发表于 2017-5-4 08:50
这个确实是个问题，上个月 GB 4789.15-2016 实施后我们第一时间就开始按新国标的要求操作，将霉菌培养皿正 ...

你的两个问题都很好，首先，国标是强制性的，应该按照国标方法执行的；第二，正置培养和倒置培养会有误差的。倒置培养过程中，进行观察时需要翻转平皿，生长出的孢子容易落到培养基上形成次生菌落，理论上倒置培养的结果应该偏高。但这都是理论上的，也没有经过实验验证，您要是有兴趣的话，可以验证一下，哈哈。

司马长风

fenglin1985 发表于 2017-5-4 08:50
这个确实是个问题，上个月 GB 4789.15-2016 实施后我们第一时间就开始按新国标的要求操作，将霉菌培养皿正 ...

扩大培养空间，采用大视野观察窗，平铺，观察时尽量不动培养皿。

另外说正置培养是避免在反复观察的过程中，上下颠倒平板导致霉菌孢子扩散形成次生小菌落的一种手段。这一点我个人持保留意见。且不说倒置培养的话，孢子向下落在平皿盖上更不容易导致主菌落周围次生小菌落，并且会完全避免冷凝水的问题，培养空间的浮游孢子一般也不会拐着弯儿往倒置平皿上长吧？倒置状态难道不能观察和计数吗？不好观察的话，抬高，仰视一下也很容易。

devil0456

fenglin1985 发表于 2017-5-4 08:50
这个确实是个问题，上个月 GB 4789.15-2016 实施后我们第一时间就开始按新国标的要求操作，将霉菌培养皿正 ...

1、违反标准，不是正确操作
2、正置可以提高检出率，但要注意一些细节，防止孢子扩散，例如，平皿不要放到正对培养箱风口。。。

foodwifi

很好的问题，提前收藏学习了

pk001007

非常专业，学习了，个人做过微生物实验，感觉正置，霉菌菌落生在很不规则。倒置，除了菌落生在规则，由于重力的左右，形成的霉菌菌图更明了，降低了连成一片的概率，还有培养皿内水分减低二次污染的概率。

个人分析，还是倒置，更实用。正置，不管是大肠菌群，菌落总数等等，培养皿实验应该倒置为佳

india5301314

司马长风 发表于 2017-5-4 09:24
扩大培养空间，采用大视野观察窗，平铺，观察时尽量不动培养皿。

另外说正置培养是避免在反复观察的过 ...

我同意你的观点！实际操作中，正置，不如倒置！已经在实验操作中，有所体会！

cxf0000

这个资料分析的很好。。。。。。。。。。

lei886688

我们也对比了几次，正置培养容易污染。我们使用一次性平皿，空白试验结果，正置培养有霉菌生长，而倒置培养就无霉菌生长。

司马长风

lei886688 发表于 2017-5-10 21:24
我们也对比了几次，正置培养容易污染。我们使用一次性平皿，空白试验结果，正置培养有霉菌生长，而倒置培养 ...

所以说，正置培养的实验数据依据在哪？