什么是微生物？

微生物（microorganism, microbe）是一些肉眼看不见的微小生物的总称。包括属于原核类的细菌、放线菌、支原体、立克次氏体、衣原体和蓝细菌（过去称蓝藻或蓝绿藻），属于真核类的真菌（酵母菌和霉菌）、原生动物和显微藻类，以及属于非细胞类的病毒、类病毒和朊病毒等。
　　微生物千姿百态，有些是腐败性的，即引起食品气味和组织结构发生不良变化。当然有些微生物是有益的，它们可用来生产如奶酪，面包，泡菜，啤酒和葡萄酒。微生物非常小，必须通过显微镜放大约1000倍才能看到。比如中等大小的细菌，1000个叠加在一起只有句号那么大。想像一下一滴牛奶，每毫升腐败的牛奶中约有5千万个细菌，或者讲每夸脱牛奶中细菌总数约为50亿。也就是一滴牛奶中可有含有50亿个细菌。
微生物学概述

微生物学是生物学的分支学科之一，它是研究各类微小生物，如细菌、放线菌、真菌、病毒、立克次氏体、枝原体、衣原体、原生动物以及藻类等的形态、生理、生物化学、分类和生态的科学。
微生物学发展简史
自古以来，人类在日常生活和生产实践中，已经觉察到微生物的生命活动及其所发生的作用。中国利用微生物进行酿酒的历史，可以追溯到4000多年前的龙山文化时期。殷商时代的甲骨文中刻有“酒”字。北魏贾思勰的《齐民要术》中，列有谷物制曲，酿酒、制酱、造醋和腌菜等方法。
在古希腊留下来的石刻上，记有酿酒的操作过程。中国在春秋战国时期，就已经利用微生物分解有机物质的作用，进行沤粪积肥。公元二世纪的《神农本草经》中，有白僵蚕治病的记载。公园六世纪的《左传》中，有用麦曲治腹泻病的记载。在10世纪的《医宗金鉴》中，有关于种痘方法的记载。1796年，英国人琴纳发明了牛痘苗，为免疫学的发展奠定了基础。
17世纪，荷兰人列文虎克用自制的简单显微镜(可放大160～260倍)观察牙垢、雨水、井水和植物浸液后，发现其中有许多运动着的“微小动物”，并用文字和图画科学地记载了人类最早看见的“微小动物”——细菌的不同形态(球状、杆状和螺旋状等)。过了不久，意大利植物学家米凯利也用简单的显微镜观察了真菌的形态。
1838年，德国动物学家埃伦贝格在《纤毛虫是真正的有机体》一书中，把纤毛虫纲分为22科，其中包括3个细菌的科(他将细菌看作动物)，并且创用细菌一词。1854年，德国植物学家科恩发现杆状细菌的芽孢，他将细菌归属于植物界，确定了此后百年间细菌的分类地位。
微生物学的研究从19世纪60年代开始进入生理学阶段。法国科学家巴斯德对微生物生理学的研究为现代微生物学奠定了基础。他论证酒和醋的酿造以及一些物质的腐败都是由一定种类的微生物引起的发酵过程，并不是发酵或腐败产生微生物；他认为发酵是微生物在没有空气的环境中的呼吸作用，而酒的变质则是有害微生物生长的结果；他进一步证明不同微生物种类各有独特的代谢机能，各自需要不同的生活条件并引起不同的作用；他提出了防止酒变质的加热灭菌法，后来被人称为巴斯德灭菌法，使用这一方法可使新生产的葡萄酒和啤酒长期保存。
后来，他开始研究人、禽、畜的传染病(狂犬病、炭疽病和鸡霍乱等)，创立了病原微生物是传染病因的正确理论，和应用菌苗接种预防传染病的方法。巴斯德在微生物学各方面的科学研究成果，促进了医学、发酵工业和农业的发展。
与巴斯德同时代的德国微生物学家科赫对新兴的医学微生物学作出了巨大贡献。科赫首先论证炭疽杆菌是炭疽病的病原苗，接着又发现结核病和霍乱的病原细菌，并提倡采用消毒和杀菌方法防止这些疾病的传播；他的学生们也陆续发现白喉，肺炎、破伤风、鼠疫等的病原细菌，导致了当时和以后数十年间人们对细菌给予高度的重视；他首创细菌的染色方法，采用了以琼脂作凝固培养基培养细菌和分离单苗落而获得纯培养的操作过程；他规定了鉴定病原细菌的方法和步骤，提出著名的科赫法则。
1860年，英国外科医生利斯特应用药物杀菌，并创立了无菌的外科手术操作方法。1901年，著名细菌学家和动物学家梅契尼科夫发现白细胞吞噬细菌的作用，对免疫学的发展作出了贡献。
俄国出生的法国微生物学家维诺格拉茨基于1887年发现硫磺细菌，1890年发现硝化细菌，他论证了土壤中硫化作用和硝化作用的微生物学过程以及这些细菌的化能营养特性。他最先发现嫌气性的自生固氮细菌，并运用无机培养基、选择性培养基以及富集培养等原理和方法，研究土壤细菌各个生理类群的生命活动，揭示土壤微生物参与土壤物质转化的各种作用，为土壤微生物学的发展奠定了基础。
1892年，俄国植物生理学家伊万诺夫斯基发现烟草花叶病原体是比细菌还小的、能通过细菌过滤器的，光学显微镜不能窥测的生物，称之为过滤性病毒。1915～1917年，特沃特和埃雷尔观察细菌苗落上出现噬菌斑以及培养液中的溶菌现象，发现了细菌病毒——噬菌体。病毒的发现使人们对生物的概念从细胞形态扩大到了非细胞形态。
20世纪以来，生物化学和生物物理学向微生物学渗透，再加上电子显微镜的发明和同位素示踪原子的应用，推动了微生物学向生物化学阶段的发展。1897年德国学者毕希纳发现酵母菌的无细胞提取液能与酵母一样具有发酵糖液产生乙醇的作用，从而认识了酵母菌酒精发酵的酶促过程，将微生物生命活动与酶化学结合起来。
诺伊贝格等人对酵母菌生理的研究和对酒精发酵中间产物的分析，克勒伊沃对微生物代谢的研究以及他所开拓的比较生物化学的研究方向，其他许多人以大肠杆菌为材料所进行的一系列基本生理和代谢途径的研究，都阐明了生物体的代谢规律和控制其代谢的基本原理，并且在控制微生物代谢的基础上扩大利用微生物，发展酶学，推动了生物化学的发展。从20世纪30年代起，人们利用微生物进行乙醇、丙酮、丁醇、甘油、各种有机酸、氨基酸、蛋白质、油脂等的工业化生产。
1929年，弗莱明发现青霉菌能抑制葡萄球菌的生长，揭示了微生物间的拮抗关系，并发现了青霉素。1949年，瓦克斯曼在他多年研究土壤微生物所积累资料的基础上，发现了链霉素。此后陆续发现的新抗生素越来越多。这些抗生素除医用外，也应用于防治动植物的病害和食品保藏。
1941年，比德尔和塔特姆用X射线和紫外线照射链孢霉，使其产生变异，获得营养缺陷型。他们对营养缺陷型的研究不仅可以进一步了解基因的作用和本质，而且为分子遗传学打下了基础。1944年，埃弗里第一次证实了引起肺炎球菌形成荚膜遗传性状转化的物质是脱氧核糖核酸(DNA)。1953年，沃森和克里克提出了DNA分子的双螺旋结构模型和核酸半保留复制学说。
富兰克尔-康拉特等通过烟草花叶病毒重组试验，证明核糖核酸(RNA)是遗传信息的载体，为奠定分子生物学基础起了重要作用。其后，又相继发现转运核糖核酸(tRNA)的作用机制、基因三联密码的论说、病毒的细微结构和感染增殖过程、生物固氮机制等微生物学中的重要理论，展示了微生物学广阔的应用前景。
1957年，科恩伯格等成功地进行了DNA的体外组合和操纵。近年来，原核微生物基因重组的研究不断获得进展，胰岛素已用基因转移的大肠杆菌发酵生产，干扰素也已开始用细菌生产。现代微生物学的研究将继续向分子水平深入，向生产的深度和广度发展。
在微生物学的发展过程中，按照研究内容和目的的不同，相继建立了许多分支学科：研究微生物基本性状的有关基础理论的有微生物形态学、微生物分类学、微生物生理学、微生物遗传学和微生物生态学；研究微生物各个类群的有细菌学、真菌学、藻类学、原生动物学、病毒学等；研究在实践中应用微生物的有医学微生物学、工业微生物学、农业微生物学、食品微生物学、乳品微生物学、石油微生物学、土壤微生物学、水的微生物学饲料微生物学、环境微生物学、免疫学等。
由于微生物学各分支学科的相互配合、互相促进，以及与生物化学、生物物理学、分子生物学等学科的相互渗透，使其在基础理论研究和实际应用两方面都有了迅速的发展。
微生物在食品中扮演的角色
也许大家都有过这样的经验，在大热天从市场买回的一块猪肉放在厨房，没有立刻把它放在冰箱中，经过几个钟头后可能就会发出一些腐臭味；又如买回来的鲜奶虽然放在冰箱中，但日子久些常会发现有变酸、凝结的情形。此外某一学校的学生吃了便当后发生上吐下泻集体中毒的新闻也时有所闻。这些我们都已经了解可能是微生物在食物中生长，造成食品品质劣变或造成不适于食用的结果。
从市场购买回来的食物，除非在工厂里经过完全的灭菌处理，否则这些食物一定含有许多微生物。虽然微生物的种类很多，但细菌、酵母菌、霉菌和病毒乃是食物中最主要的微生物。食品中所含的这些微生物，是原料中原本污染的微生物在经过其后一连串处理、加工、保藏等措施后仍然存活，或由于再污染而存在的。
一般情况下若食品中污染的微生物数目多，可能保藏的期限就较短，而且污染有病原菌的机会也较高。食品中微生物污染的主要来源包括土壤、水、空气、植物与肥料、动物与饲料、人、加工设备、食品配料、其它食物及包装材料等。
土壤中隐藏着许多自然界的微生物，不同地区、不同气候、不同肥沃度的土壤中所隐藏的微生物数目与种类有极大的不同。水是微生物广泛存在的天然环境，江、河、湖、池、井水中均有微生物存在，而水中的微生物主要来自土壤、人畜排泄物、动植物尸体等，所以食品工厂用水均须做适当的杀菌处理，以免影响食品的品质。
虽然空气并非微生物繁殖的场所，但空气中仍然存在着不同种类与数量的微生物，而这些微生物都是其它环境中的微生物进入空气的结果。如土壤飞扬而起的尘埃，人与其体表的干燥脱落物和呼吸道的排泄物等进入空气所致。
植物本身与土壤接触，它们的表面甚至内部都可能含有微生物。至于动物如猪、牛等毛发、表皮、口腔及肠道内均有微生物存在，在屠宰过程中都可能再污染至肉品上，尽管本身健康的动物其肌肉内部是无菌的，但由于加工时所使用的设备、容器等也都可能含有微生物，特别是在使用后未做适当的清洗、杀菌时，它们所含的微生物都可能再污染到所处理或放置的食物中

影响微生物生长与死亡的因素

生长是微生物与外界环境因素共同作用的结果。环境条件的改变，可引起微生物形态、生理、生长、繁殖等特征的改变；或者抵抗、适应环境条件的某些改变；当环境条件的变化超过一定极限，则导致微生物的死亡。
　　为了抑制和消除微生物的有害作用，人们常采用多种物理、化学或生物学方法，来抑制或杀死微生物。常用以下术语来表示对微生物的杀灭程度。
　　灭菌：用物理或化学方法杀灭物体上所有的微生物（包括病原微生物和非病原微生物及细菌芽胞、霉菌孢子等），称为灭菌。
　　消毒：用物理或化学方法仅能杀灭物体上的病原微生物，而对非病原微生物及芽胞和孢子不一定完全杀死，称为消毒。用来消毒的药物称为消毒剂。
　　防腐：防止或抑制微生物生长和繁殖的方法称为防腐或抑菌。用于防腐的化学药品称为防腐剂。某些化学药物在低浓度时为防腐剂，在高浓度时则成为消毒剂。
　　无菌：指没有活的微生物存在。采取防止或杜绝一切微生物进入动物机体或物体的方法，称为无菌法。以无菌法操作时称为无菌操作。在进行外科手术或微生物学实验时，要求严格的无菌操作，防止微生物的污染。
　　不同的微生物对各种理化因子的敏感性不同，同一因素不同剂量对微生物的效应也不同，或者起灭菌作用，或者可能只起消毒或防腐作用。在了解和应用任何一种理化因素对微生物的抑制或致死作用时，还应考虑多种因素的综合效应。例如在增高温度的同时加入另一种化学药剂，则可加速对微生物的破坏作用。大肠杆菌在有酚存在的情况下，温度从30℃增至42℃时明显加快死亡；微生物的生理状态也影响理化因子的作用。营养细胞一般较孢子抗逆性差，幼龄的、代谢活跃的细胞较之老龄的、休眠的细胞易被破坏；微生物生长的培养基以及它们所处的环境对微生物遭受破坏的效应也有明显的影响。如在酸或碱中，热对微生物的破坏作用加大，培养基的粘度也影响抗菌因子的穿透能力；有机质的存在也干扰抗微生物化学因子的效应，或者由于有机物与化学药剂结合而使之失效，或者有机质覆盖于细胞表面，阻碍了化学药剂的渗入。
　　常见的影响微生物生长与死亡的物理、化学因素主要有：
1.温度：
　　温度是影响有机体生长与存活的最重要的因素之一。它对生活机体的影响表现在两方面：一方面随着温度的上升，细胞中的生物化学反应速率和生长速率加快。在一般情况下，温度每升高10℃，生化反应速率增加一倍；另一方面，机体的重要组成如蛋白质、核酸等对温度都较敏感，随着温度的增高而可能遭受不可逆的破坏。因此，只有在一定范围内，机体的代谢活动与生长繁殖才随着温度的上升而增加，当温度上升到一定程度，开始对机体产生不利影响，如再继续升高，则细胞功能急剧下降以至死亡。
　　就总体而言，微生物生长的温度范围较广，已知的微生物在零下12-100℃均可生长。而每一种微生物只能在一定的温度范围内生长。各种微生物都有其生长繁殖的最低温度、最适温度、最高温度和致死温度。
　　最低生长温度：是指微生物进行繁殖的最低温度界限，如果低于此温度，则生长完全停止。
　　最适生长温度：能够使微生物迅速生长繁殖的温度叫做最适生长温度，在此温度下，微生物群体生长繁殖速度最快，代时最短。不同微生物的最适生长温度是不一样的。
　　最高生长温度：是指微生物生长繁殖的最高温度界限。
　　致死温度：最高生长温度若进一步升高，便可杀死微生物，这种致死微生物的最低温度界限即为致死温度，致死温度与处理时间有关。
　　微生物按其生长温度范围可分为低温微生物、中温微生物和高温微生物三类。　
2.氢离子浓度(pH)：
　　环境中的酸碱度通常以氢离子浓度的负对数即pH值来表示。环境中的pH值对微生物的生命活动影响很大，主要作用在于：引起细胞膜电荷的变化，从而影响了微生物对营养物质的吸收；影响代谢过程中酶的活性；改变生长环境中营养物质的可给性以及有害物质的毒性。
　　每种微生物都有其最适pH值和一定的pH范围。在最适范围内酶活性最高，如果其他条件适合，微生物的生长速率也最高。大多数细菌、藻类和原生动物的最适pH为6.5-7.5，在pH 4-10之间也可以生长；放线菌一般在微碱性即pH7.5-8最适合；酵母菌、霉菌则适合于pH5-6的酸性环境，但生存范围在pH1.5-10之间。有些细菌甚至可在强酸性或强碱性环境中生活。
　　微生物在基质中生长，代谢作用改变了基质中氢离子浓度。随着环境pH值的不断变化，微生物生长受阻，当超过最低或最高pH值时，将引起微生物的死亡。为了维持微生物生长过程中pH值的稳定，配制培养基时要注意调节pH值，而且往往还要加入缓冲物以保证pH在微生物生长繁殖过程中的相对稳定。
　　强酸和强碱具有杀菌力。无机酸杀菌力虽强，但腐蚀性大。某些有机酸如苯甲酸可用做防腐剂。强碱可用作杀菌剂，但由于它们的毒性大，其用途局限于对排泄物及仓库、棚舍等环境的消毒。强碱对革兰氏阴性细菌与病毒比对革兰氏阳性细菌作用强。
3.氧化还原电位：
　　氧化还原电位(Φ)对微生物生长有明显影响。环境中Φ值与氧分压有关，也受pH的影响。pH值低时，氧化还原电位高；pH值高时，氧化还原电位低。
　　各种微生物生长所要求的Φ值不一样。一般好氧性微生物在Φ值＋0.1伏以上均可生长，以Φ值为＋0.3伏－＋0.4伏时为适。厌氧性微生物只能在Φ值低于＋0.1伏以下生长。兼性厌氧微生物在＋0.1伏以上时进行好氧呼吸，在＋0.1伏以下时进行发酵。
4.辐射：
　　辐射是指通过空气或外层空间以波动方式从一个地方传播或传递到另一个地方的能源。它们或是离子或是是电磁波。电磁辐射包括可见光、红外线、紫外线、X射线和Υ射线等。
(1)紫外辐射 紫外线是非电离辐射，以波长265-266纳米的杀菌力最强。紫外辐射对微生物有明显的致死作用，是强杀菌剂，紫外杀菌灯管在医疗卫生和无菌操作中广泛应用。由于紫外线穿透能力差，不易透过不透明的物质，故紫外杀菌灯只适用于空气及物体表面消毒。
(2)电离辐射X射线与α射线、β射线和Υ射线均为电离辐射。在足够剂量时，对各种细菌均有致死作用。常用于一次性塑料制品的消毒，也用于食品的消毒。
5.干燥：
　　水分是微生物的正常生命活动必不可少的。干燥会导致细胞失水而造成代谢停止以至死亡。微生物的种类，环境条件，干燥的程度等均影响干燥对微生物的效果。休眠孢子抗干燥能力也很强，在干燥条件下可长期不死，这一特性已用于菌种保藏，如用砂土管来保藏有孢子的菌种。在日常生活中也常用烘干、晒干和熏干等方法来保存食物。
6.渗透压：
　　水或其他溶剂经过半透性膜而进行扩散的现象就是渗透。在渗透时溶剂通过半透性膜时的压力即谓渗透压。其大小与溶液浓度成正比。
　　适宜于微生物生长的渗透压范围较广，而且它们往往对渗透压有一定的适应能力。突然改变渗透压会使微生物失去活性，逐渐改变渗透压，微生物常能适应这种改变。对一般微生物来说，它们的细胞若置于高渗溶液中，水将通过细胞膜从低浓度的细胞内进入细胞周围的溶液中，造成细胞脱水而引起质壁分离，使细胞不能生长甚至死亡。相反，若将微生物置于低渗溶液或水中，外环境中的水将从溶液进入细胞内引起细胞膨胀，甚至使细胞破裂。
　　由于一般微生物不能耐受高渗透压，所以日常生活中常用高浓度的盐或糖保存食物，如腌渍蔬菜、肉类及蜜饯等。
7.超声波：
　　超声波具有强烈的生物学作用。超声波的作用是使细胞破裂，所以几乎所有的微生物都能受其破坏，其效果与频率、处理时间、微生物种类、细胞大小、形状及数量等均有关系。
8.重金属及其化合物：
　　一些重金属离子是微生物细胞的组成成分，当培养基中这些重金属离子浓度低时，对微生物生长有促进作用，反之会产生毒害作用；也有些重金属离子的存在，不管浓度大小，对微生物的生长均会产生有害或致死作用。因此，大多数重金属及其化合物都是有效的杀菌剂或防腐剂。其作用最强的是Hg、Ag和Cu。如：二氯化汞又名升汞，是杀菌力极强的消毒剂。0.1-1%浓度的硝酸银常用于皮肤的消毒。
9.有机化合物：
　　对微生物具有有害效应的有机化合物种类很多，其中酚、醇、醛等能使蛋白质变性，是常用的杀菌剂。
　　酚：酚又名石炭酸。它们对细菌的有害作用可能主要是使蛋白质变性，同时又有表面活性的作用，破坏细胞膜的透性，使细胞内含物外溢。当浓度高时是致死因子，反之则起抑菌作用。
　　甲酚是酚的衍生物。杀菌力比酚强几倍。甲酚在水中的溶解度较低，但在皂液与碱性溶液中易形成乳液。市售的消毒剂煤酚皂液（来苏尔）就是甲酚与肥皂的混合液，常用3-5%的溶液来消毒皮肤、桌面及用具等。
　　醇：它是脱水剂、蛋白质变性剂，也是脂溶剂，可使蛋白质脱水、变性，损害细胞膜而具杀菌能力。乙醇是普遍使用的消毒剂，常用于实验室内的玻棒、玻片及其他用具的消毒。50-70％的乙醇便可杀死营养细胞；70%的乙醇杀菌效果最好，超过70%以至无水酒精效果较差。
　　甲醛：甲醛也是一种常用的杀细菌与杀真菌剂，效果良好。纯甲醛为气体状，可溶于水，市售的福尔马林溶液就是37-40％的甲醛水溶液。
10.卤族元素及其化合物：
　　碘：是强杀菌剂。3-7%碘溶于70-83%的乙醇中配制成碘酊，是皮肤及小伤口有效的消毒剂。碘一般都作外用药。
　　氯气或氯化物：这是一类最广泛应用的消毒剂。 氯气一般用于饮水的消毒，次氯酸盐等常用作食品加工过程中的消毒。氯气和氯化物的杀菌机制，是氯与水结合产生了次氯酸(HClO)，次氯酸易分解产生新生态氧，这是一种强氧化剂，对微生物起破坏用。
11.表面活性剂：
　　具有降低表面张力效应的物质称为表面活性剂。这类物质加入培养基中，可影响微生物细胞的生长与分裂。如肥皂、漂白粉、洗衣粉等。
12.染料：
　　染料，特别是碱性染料，在低浓度下可抑制细菌生长。由于这些染料具有选择性抑菌的特点，故常在培养基中加入低浓度的染料配制成选择培养基。例如：碱性三苯甲烷染料，包括孔雀绿、亮绿、结晶紫等，对革兰氏阳性菌有很强的抑制作用。
13．化学疗剂：
　　能直接干扰病原微生物的生长繁殖并可用于治疗感染性疾病的化学药物即为化学疗剂。它能选择性地作用于病原微生物新陈代谢的某个环节，使其生长受到抑制或致死。但对人体细胞毒性较小，故常用于口服或注射。

微生物的营养要求

微生物生长繁殖所需的营养物质主要有水、碳源、氮源、无机盐和生长因子等。
　　水：水是各种生物细胞必需的。水是良好的溶剂，微生物的新陈代谢过程中的一切生化反应都离不开水的作用。
　　碳源：碳源是合成菌体成分的原料，也是微生物获取能量的主要来源。整体上看来，微生物可以利用的碳源范围极广，从大类上说，可以分为有机碳源和无机碳源两大类，凡必须利用有机碳源的微生物就是异养微生物，凡能利用无机碳源的微生物就是自养微生物。糖类是最广泛利用的碳源。
　　氮源：氮源主要是供给合成菌体结构的原料，很少作为能源利用。与碳源相似，微生物作为一个整体来说，能利用的碳源种类十分广泛。某些微生物（如固氮菌）能利用空气中分子态的氮或利用无机氮化物如铵盐、硝酸盐合成有机氮化物。多数致病菌则必须供给蛋白胨、氨基酸等有机氮化物才能生长。
　　无机盐类：无机盐主要可为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素。微生物需要的无机盐类很多，主要有P、S、K、Na、Ca、Mg、Fe等，其主要功能为构成菌体成分；调节渗透压；作为某些酶的成分，并能激活酶的活性等。
　　生长因子：有些微生物虽然供给它适合的碳源氮源和无机盐类，仍不能生长，还要供给一定量的所谓“生长因子”。其种类很多，主要是B族维生素的化合物等。生长因子可以从酵母浸出液、血液或血清中获得。
高压蒸汽灭菌锅的操作过程与注意事项

(1)准备。将灭菌锅放在2000瓦电炉上，或放在有足够火力的煤气灶、煤炉上，向锅内加水至水位标记线为止。将准备灭菌的培养基及空玻璃器皿用牛皮纸包好，装入锅内套层中，物品放置不宜过多，过挤，锅内应留出三分之一空间。然后盖严锅盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，关闭锅盖上的气阀。
(2)加热。点燃热源，开始加热。当锅盖上的压力表达到0.5千克/厘米2时，打开放气阀，排净锅内冷空气，直到压力表回降到“0”时，关闭气阀，继续加热。当压力表上升到所需压力时（一般为1千克/厘米2），开始计算灭菌时间。此时应适当关小热源，不断调节热源大小，使压力始终维持在所需数值上，达到保压时间后，停止加热，使灭菌锅内压力自然下降。
(3)结束。待压力表降至“0”时，拧松螺旋，半开锅盖，用锅内余热烘干盖纸，10分钟后取出灭菌物品。
(4)注意事项。在灭菌过程中，应注意排净锅内冷空气，锅内冷空气如排放不净，会影响灭菌效果，达不到彻底灭菌的目的。由于高压蒸汽灭菌时，要使用温度高达120℃、两个大气压的过热蒸汽，操作时，必须严格按照操作规程操作，否则容易发生意外事故。

各菌种保存方法的优缺点

1．斜面低温保藏法
　　将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。
　　保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。
　　此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。
2．液体石蜡保藏法
　　（1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。
　　（2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。
　　（3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。
　　（4）将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长）。
　　此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1—2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。
3．滤纸保藏法
　　（1）将滤纸剪成0．5×1．2cm的小条，装入0．6×8cm的安瓿管中，每管1—2张，塞以棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟。
　　（2）将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长。
　　（3）取灭菌脱脂牛乳1—2ml滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。
　　（4）用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。
　　（5）将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。
　　（6）将棉花塞入管内，用火焰按图Ⅶ-13熔封，保存于低温下。
　　（7）需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热，滴一滴冷水在烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉口端的玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。
　　细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏14—17年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。
4．沙土保藏法
　　（1）取河沙加入10％稀盐酸，加热煮沸30分钟，以去除其中的有机质。
　　（2）倒去酸水，用自来水冲洗至中性。
　　（3）烘干，用40目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用。
　　（4）另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。
　　（5）烘干，碾碎，通过100目筛子过筛，以去除粗颗粒。
　　（6）按一份黄土、三份沙的比例（或根据需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）掺合均匀，装入10×100mm的小试管或安瓿管中，每管装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌，烘干。
　　（7）抽样进行无菌检查，每10支沙土管抽一支，将沙土倒入肉汤培养基中，37℃培养48小时，若仍有杂菌，则需全部重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌，方可备用。
　　（8）选择培养成熟的（一般指孢子层生长丰满的，营养细胞用此法效果不好）优良菌种，以无菌水洗下，制成孢子悬液。
　　（9）于每支沙土管中加入约0．5ml（一般以刚刚使沙土润湿为宜）孢子悬液，以接种针拌匀。
　　（10）放入真空干燥器内，用真空泵抽干水分，抽干时间越短越好，务使在12小时内抽干。
　　（11）每10支抽取一支，用接种环取出少数沙粒，接种于斜面培养基上，进行培养，观察生长情况和有无杂菌生长，如出现杂菌或菌落数很少或根本不长，则说明制作的沙土管有问题，尚须进一步抽样检查。
　　（12）若经检查没有问题，用火焰熔封管口，放冰箱或室内干燥处保存。每半年检查一次活力和杂菌情况。
　　（13）需要使用菌种，复活培养时，取沙土少许移入液体培养基内，置温箱中培养。
　　此法多用于能产生孢子的微生物如霉菌、放线菌，因此在抗生素工业生产中应用最广，效果亦好，可保存2年左右，但应用于营养细胞效果不佳。
5．液氮冷冻保藏法
　　（1）准备安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1．2mm液体的。
　　（2）加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞，1．05kg/cm2，121．3℃灭菌15分钟：若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10％的甘油蒸馏水溶液或10％二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌15分钟。
　　（3）接入菌种将菌种用10％的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。
　　（4）冻结再将已封口的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。
　　（5）保藏经冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃，液态氮内为-196℃。
　　（6）恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入38—40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。
　　此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。
6．冷冻干燥保藏法
　　（1）准备安瓿管用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安瓿管，大小要求外径6—7．5mm，长105mm，球部直径9—11mm，壁厚0．6—1．2mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟，备用。
　　（2）准备菌种，用冷冻干燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至十数年，为了在许多年后不出差错，故所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般，细菌要求24—48小时的培养物；酵母需培养3天；形成孢子的微生物则宜保存孢子；放线菌与丝状真菌则培养7—10天。
　　（3）制备菌悬液与分装以细菌斜面为例，用脱脂牛乳2ml左右加入斜面试管中，制成浓菌液，每支安瓿管分装0．2ml。
　　（4）冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。
　　将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体CO2>）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃。将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻4—5分钟，即可使悬液结冰。
　　（5）真空干燥为在真空干燥时使样品保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15℃。
　　抽气一般若在30分钟内能达到93．3Pa（0．7mmHg）真空度时，则干燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度26．7Pa（0．2mmHg），保持压力6—8小时即可。
　　（6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管（图Ⅶ-17）继续抽气，约10分钟即可达到26．7Pa（0．2mmHg）。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后，保存于冰箱或室温暗处。